在Hep G2細(xì)胞中利用siRNA沉默GFP基因的實(shí)驗(yàn)探討.pdf

1、針對(duì)同源序列的siRNA能高效、特異性沉默靶基因mRNA，而不影響細(xì)胞其他的基因功能，是治療腫瘤和病毒感染性疾病最有前景的基因治療方法之一。本研究采用siRNA/脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染，在肝癌細(xì)胞Hep G2中導(dǎo)入特定的siRNA，研究其在Hep G2細(xì)胞中的細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率和該siRNA對(duì)靶基因的沉默效果，建立一種有效的基因沉默途徑，為肝癌的治療和基礎(chǔ)研究提供參考。
　　 目的：在Hep G2細(xì)胞中利用siRNA沉默GFP基因，研究

2、其生物學(xué)指標(biāo)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)siRNA和siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物的穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估；
　　 (2)通過(guò)熒光標(biāo)記技術(shù)，研究不同時(shí)間siRNA脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率；
　　 (3)通過(guò)熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞和RT-PCR檢測(cè)靶基因mRNA表達(dá)，確定不同種類(lèi)、形式、劑量的siRNA對(duì)靶基因的沉默效能。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在不含血

3、清的DMEM培養(yǎng)液中，siRNA和siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物可穩(wěn)定至4h,在5%血清中2～4h后明顯降解；
　　 (2)100nM的siRNA和siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物無(wú)明顯細(xì)胞毒性；
　　 (3)siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的效率隨時(shí)間不同而不同，4h可達(dá)90%；
　　 (4)非特異性siRNA和siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物無(wú)沉默靶基因表達(dá)作用，特異性siRNA/脂質(zhì)體對(duì)靶基因的沉默作用在一定范圍內(nèi)隨劑量升高（20nM