反向重復結構不同位置側翼序列誘導的基因沉默差異比較.pdf

1、RNA沉默是生物(特別是真核生物)抵御外來核酸(病毒、轉座子、轉基因甚至人工注射的雙鏈RNA)入侵的一種防御機制，它廣泛存在于各種生物中。本研究主要內容是分別在植物表達載體pRIR202反向重復結構的上游、中間間隔區(qū)(Loop環(huán))、下游插入GFP基因5'端的521 bp片段，通過瞬時表達系統(tǒng)比較反向重復結構不同位置側翼序列誘導基因沉默的差異，從而為培育多抗病毒轉基因植物，長時間高水平維持RNA介導的抗病性提供理論依據(jù)。 具體結果

2、如下： 1.克隆GFP 5'端的521 bp片段，分別插入植物表達載體pRIR202反向重復結構的上游、中間間隔區(qū)(Loop環(huán))、下游，成功構建了植物雙元表達載體pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN，并用凍融法導入農桿菌C58C1中。 2.用農桿菌共浸潤(滲入)的方法，將帶質粒的農桿菌注射入帶有GFP基因的單拷貝純合體轉基因煙草Nicotiana benthamiana line16C，以注射p

3、RIR202為空白對照。在長波(365 nm)紫外燈照射下，4天后在注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的部位都出現(xiàn)了紅色暈圈，并且隨時間變化紅色部位逐步蔓延和加強，而且pRIR202MID和pRIR202DWN的沉默效果強于pRIR202UP。 3.利用實時熒光定量PCR技術，從分子水平檢測基因沉默的強度，9天后檢測GFP mRNA的相對累積量。注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR20

4、2MID、pRIR202DWN的植株中的GFP mRNA積累量分別為1.0000、0.6598、0.4175和0.3209。23天后檢測GFP mRNA的相對累積量，依次分別為1.0000、0.2169、0.1996和0.1654。通過分析比較可以得出基因沉默的強弱依次為pRIR202DWN、pRIR202MID和pRIR202UP。 4.利用Western blot從蛋白水平分析GFP的含量，以注射pRIR202的野生型煙草(

5、N.benthamiana)為陰性對照，注射pRIR202的轉基因煙草(N.benthamiana line 16C)為陽性對照，野生型煙草的煙草中檢測不到GFP蛋白，而注射pRIR202、pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C植株中都檢測到TGFP蛋白，而且注射pRIR202的16C中GFP的蛋白含量明顯多于注射pRIR202UP、pRIR202MID和pRIR202DWN的16C煙草，注射pRIR2