T9代“玉米稻”中玉米DNA側(cè)翼序列的鑒定與克隆.pdf

1、本實驗室通過遠(yuǎn)緣分子雜交技術(shù)將玉米DNA導(dǎo)入水稻，獲得了大量的水稻變異材料，經(jīng)過多代自交篩選，得到一批具有與供體玉米性狀相似、能穩(wěn)定遺傳的水稻變異株系。本研究選取穩(wěn)定遺傳至第九代的水稻變異株系131-5-2作為研究材料，鑒定和克隆玉米DNA片段，旨在為遠(yuǎn)緣分子雜交育種技術(shù)介導(dǎo)玉米DNA創(chuàng)造水稻新種質(zhì)提供理論數(shù)據(jù)。
　　本實驗室用AFLP技術(shù)在T7代水稻變異株系131-5-2中獲得一條長為349bp的玉米DNA片段(P5M3-131

2、-349)，本研究采用Nested PCR方法在T9代變異株系131-5-2中對該序列進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，在T9代變異株系131-5-2中擴(kuò)增出一條212bp的目的片段。經(jīng)BALST分析，該片段與在陽性對照玉米中擴(kuò)增出的目的帶匹配率為100％；與P5M3-131-349序列的匹配率為99.54％，僅有一個堿基的差異。說明在T9代變異株系131-5-2中仍然存在P5M3-131-349序列，該序列已完全整合到變異株系基因組中并能穩(wěn)定遺傳。

3、
　　經(jīng)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中的Blast工具比對，P5M3-131-349序列位于玉米第10號染色體上。根據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中公布的玉米第10號染色體堿基序列，設(shè)計一對引物HF/HR，以基因組DNA為模版，對P5M3-131-349序列進(jìn)行3’端側(cè)翼序列擴(kuò)增，在陽性對照玉米和T9代變異株系131-5-2中均擴(kuò)增到一條長為541bp的目的條帶(在陰性對照水稻中沒有擴(kuò)增出目的帶)，經(jīng)BALST分析，T9代變異株系131-5-

4、2中擴(kuò)增出的目的條帶(P5M3-349-541)與陽性對照玉米中擴(kuò)增出的目的帶的核苷酸同源性為100％。P5M3-349-541和P5M3-131-349序列經(jīng)DNAStar軟件拼接后得到一條長為597bp的DNA片段(P5M3-349-597)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，對P5M3-349-597序列進(jìn)行Blastn序列檢索。結(jié)果顯示，該序列與GeneBank登錄號為FU963081.1的玉米mRNA具有100％的核苷酸同源性，并且該序列位

5、于EU963081.1的第260-856位堿基之間。EU963081.1翻譯的蛋白質(zhì)為半胱氨酸型內(nèi)肽酶/泛素硫酯酶。這進(jìn)一步證明水稻變異株系基因組中整合有玉米DNA，并且具有編碼蛋白質(zhì)的功能。
　　半胱氨酸型內(nèi)肽酶/泛素硫酯酶蛋白含有495個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，具有2次跨膜疏水區(qū)，主要位于質(zhì)膜、葉綠體體膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜上，其在葉綠體膜上的可能性最大。水稻變異株系131-5-