水稻T-DNA插入突變群體側翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是最重要的糧食作物之一。隨著水稻全基因組序列的測定，以解析水稻全部基因功能為目標的功能基因組研究已成為水稻基因組學研究的重點。大型突變體庫是水稻功能基因組研究的重要技術平臺，插入突變群體是這一平臺的一個主要技術支撐。由于插入突變體突變表型和基因型之間的關聯(lián)可以便捷地通過分離插入元件的側翼序列進行鑒定，側翼序列分離便成為利用插入突變群體進行功能基因組研究的關鍵工作。tRNA是蛋白質合成等多種生命活動不可或缺

2、的重要組分。tRNA以前體形式轉錄，需要去除5'和3'端附加序列等一系列加工才能成為有活性的功能分子。目前植物中關于tRNA3'端加工的分子機制還所知甚少。本研究以本實驗室建立的RMD大規(guī)模T-DNA插入突變體庫為材料，進行了大量的側翼序列分離和突變表型篩選工作。在此基礎上，本研究結合農桿菌侵染后6小時水稻愈傷組織的表達譜數據和72，090條側翼序列對T-DNA和Tos17插入位點的分布與序列特征進行了分析，并對影響插入位點發(fā)掘的因素進

3、行了推測。此外，本研究還利用一個白化苗突變體克隆和鑒定了一個參與葉綠體tRNA3'端加工的tRNase Z編碼基因，OsaTRZ2。
　　本研究主要內容包括：⑴完成了對2，037個T0代獨立轉化植株的PCR陽性檢測，陽性率為85.7％。⑵使用TAIL-PCR、反向PCR和接頭PCR等方法從7，548份突變體材料中分離到5，711條可定位于水稻基因組上的T-DNA和Tos17側翼序列（E-value＜10-5）。⑶通過分析T-DNA

4、和Tos17插入位點在基因組不同層級上的分布發(fā)現(xiàn)中花11號和日本晴遺傳背景下T-DNA和Tos17插入位點分別展示出了相似的分布特征，表明不同粳稻遺傳背景下影響插入位點發(fā)掘的因素類似。⑷通過分析轉錄活性分布與T-DNA或Tos17插入位點分布的相關性發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點的分布在全基因組范圍內，尤其在基因區(qū)內，與染色質轉錄活性呈高度正相關。而Tos17插入位點的主要集中區(qū)有一半都位于染色質上轉錄活性相對較低的區(qū)域，并且在基因區(qū)內Tos1

5、7插入位點的分布與基因表達量呈高度負相關。這些結果提示染色質轉錄活性是影響插入位點發(fā)掘的重要因素。⑸通過對插入位點臨近序列的核苷酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)在T-DNA和Tos17插入位點的3'下游都出現(xiàn)了AT含量的上升，但上升的程度與插入位點的數量呈反比，推測PCR技術對富含AT序列的偏愛是造成這種特征的原因。⑹通過對插入位點的核苷酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)G頻率在T-DNA左端插入位點5'上游5 bp范圍內出現(xiàn)連續(xù)的2％左右的下降，而在T-DNA右端

6、插入位點5'上游3 bp到3'下游1 bp位置上出現(xiàn)了2％-7％左右的上升。T-DNA左右端插入位點這種特異而微弱的堿基偏愛與T-DNA的微同源整合機制相符合。Tos17右端插入位點處出現(xiàn)了強烈的堿基偏愛，其一致序列為ANGTTGNNNCAACNT，可能是由Tos17的整合機制造成的。⑺通過對11，469個T1代突變體家系的田間表型篩選獲得了105個表型穩(wěn)定的穗部突變體家系和149個葉色突變體家系，包括4個T-DNA插入與突變表型共分離

7、的家系:LT71、06LT90、LT30和OsaTRZ2。⑻OsaTRZ2是一個白化苗家系，osatrz2突變體發(fā)芽后存活不超過4周。色素和細胞學分析表明osatrz2的葉片缺乏葉綠素并且葉片中原質體的發(fā)育停滯在向葉綠體轉化的早期階段，而osatrz2愈傷細胞中質體的數量和大小也都極度降低。⑼RT-PCR和共分離檢測表明白化表型是由于T-DNA插入到OsaTRZ2的第7個外顯子中導致轉錄本被截短造成的?；蚪M注釋表明OsaTRZ2編碼一

8、個365氨基酸長的tRNase Z。⑽遺傳互補和雙鏈RNA干涉實驗證實OsaTRZ2的破壞是造成白化表型的原因。⑾表達分析和芯片數據表明OsaTRZ2在水稻組織中呈組成型表達，但在葉片、葉鞘和愈傷等綠色組織和活躍的分生組織中表達量較高。⑿亞細胞定位實驗表明OsaTRZ2定位于葉綠體中。⒀體內和體外酶活實驗都表明OsaTRZ2具有切除tRNA前體3'端尾巴的活性。⒁對轉錄產物的分析表明OsaTRZ2失活后質體編碼的RNA聚合酶與細胞核編碼