稻曲病菌T-DNA插入突變體B-726、B-1015側(cè)翼相關(guān)基因的克隆.pdf

1、通過田間致病力試驗(yàn)，從稻曲病菌T-DNA插入突變體庫中篩選獲得了一株T-DNA插入致病力減弱的突變菌株B-726和一株致病力喪失突變菌株B-1015。本研究分析突變菌株B-726的生物學(xué)性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P(guān)1相比，突變菌株B-726在MM，TB3和PSA三種固體培養(yǎng)基上生長速率均下降。在液體培養(yǎng)基PS中，B-726的產(chǎn)生分生孢子的能力顯著降低。用PCR檢測傳代培養(yǎng)5代B-726基因組的T-DNA插入穩(wěn)定性，結(jié)果表明T-DNA能夠隨著

2、稻曲病菌的傳代穩(wěn)定遺傳。Southern雜交分析B-726外源基因插入為單拷貝。利用hiTAIL-PCR獲得T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列;運(yùn)用RACE-PCR技術(shù)，克隆與插入位點(diǎn)毗鄰的基因全長，結(jié)果得到一個(gè)全長為1296 bp，該基因由2個(gè)長度分別為406bp和798 bp的外顯子和1個(gè)長度為88 bp的內(nèi)含子組成。將該基因的cDNA全長序列開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)分析表明，包含1個(gè)長度為465 bp的

3、開放閱讀框（ORF），可編碼154個(gè)氨基酸，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）長度為110 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）的長度為631bp，將其命名為Uvt-726。序列分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點(diǎn)在Uvt-726上游344 bp處。用半定量RT-PCR分析基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示Uvt-726基因表達(dá)量在B-726中較P1顯著下降。在已知的功能蛋白基因中，沒有比對到同源基因。克隆了1個(gè)可能與稻曲病菌致病力相關(guān)的新基因，推斷該基因在稻

4、曲病菌致病過程中起著重要的作用。
　　進(jìn)一步分析稻曲病致病力喪失突變菌株B-1015的生物學(xué)性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P(guān)1相比，B-1015的生長速率明顯降低，在PS培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量也顯著降低。將T-DNA兩端側(cè)翼序列分別上傳到稻曲病菌的全基因組測序數(shù)據(jù)庫中比對，對B-1015的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入可能導(dǎo)致了稻曲病菌的基因組發(fā)生了重排。RACE PCR分別在兩邊的側(cè)翼序列上克隆得到一個(gè)基因Uvt1015R

5、和Uvt1015L。Uvt1015R基因全長為1560 bp，中間被一個(gè)長度為60 bp的內(nèi)含子隔開，兩個(gè)外顯子的長度分別為631bp和869 bp。ORF分析表明該基因包含一個(gè)長度為948bp的開放閱讀框可編碼295個(gè)氨基酸，5'-UTR長度為341 bp，3'-UTR長度為271bp。Uvt1015L基因全長556bp，不合內(nèi)含子，包含一個(gè)長度為351bp的ORF，可編碼116個(gè)氨基酸，5'-UTR為31 bp，3'-UTR長度為1

6、71 bp。序列分析發(fā)現(xiàn)T-DNA插入在兩個(gè)基因序列中間，RT-PCR結(jié)果顯示在突變菌株B-1015中Uvt1015R表達(dá)量下降，Uvt1015L基因都不表達(dá)。在已知的功能蛋白基因中，沒有比對到與這兩個(gè)基因同源基因。稻曲病菌突變菌株B-1015致病力等重要生物學(xué)表型發(fā)生改變，可能是由于T-DNA的插入導(dǎo)致了B-1015基因組重排和Uvt1015R、Uvt1015L基因結(jié)構(gòu)的破壞。
　　分離T-DNA標(biāo)記的功能基因是研究稻曲病菌致病

7、機(jī)制的前提，而解析功能基因在稻曲病菌致病過程中的作用需對基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）基因作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建UVT-726基因敲除盒。以農(nóng)桿菌質(zhì)粒PC-P1tk為載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化稻曲病菌將基因敲除盒導(dǎo)入到稻曲病菌。攜帶基因敲除盒的T-DNA轉(zhuǎn)化到稻曲病菌內(nèi)，在毒力蛋白的幫助下T-DNA發(fā)生異源整合到稻曲病菌基因組，或者發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)目的基因替換。篩選具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，用PCR檢測基因敲除的結(jié)果，旨在