稻曲病菌T--DNA插入突變體B2510的插入位點(diǎn)分析及致病相關(guān)基因Uvt3277功能的初步研究.pdf

1、水稻稻曲病是一種水稻穗部病害，現(xiàn)已由次要病害上升為主要病害。稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）是稻曲病的病原真菌，在穗部形成的稻曲球嚴(yán)重影響水稻品質(zhì)和產(chǎn)量，稻曲球產(chǎn)生的毒素能對(duì)人畜健康產(chǎn)生危害。因此深入了解稻曲病的致病機(jī)理，可以為水稻稻曲病的防治提供理論依據(jù)。
　　1、本文從稻曲病菌T-DNA插入突變體庫中篩選到一株致病力減弱的突變菌株B2510，通過分析突變菌株B2510的生物學(xué)性狀和T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼

2、基因，為稻曲病菌的分子致病機(jī)理的研究提供方法和理論依據(jù)。與野生型P1相比，突變菌株B2510喪失了產(chǎn)孢能力，生長速率在MM培養(yǎng)基上明顯降低，而在PSA和TB3培養(yǎng)基中則沒有顯著差異。Southern雜交分析T-DNA的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示T-DNA以雙拷貝形式插入到突變菌株B2510的基因組中。運(yùn)用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，獲得兩個(gè)可能與致病性有關(guān)的基因UVC6TF和UVRASGAP。T-DNA分別插在基因U

3、VC6TF的啟動(dòng)子區(qū)域和UVRASGAP的下游3'端，且稻曲基因組和T-DNA序列均未丟失。半定量RT-PCR分別分析兩個(gè)基因在突變菌株B2510中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與P1相比均顯著下降。因此推測這兩個(gè)基因與稻曲病菌致病性相關(guān)，可能在某一階段參與調(diào)控稻曲病菌在水稻上的致病過程。為進(jìn)一步了解基因的功能，構(gòu)建基因UVC6TF的沉默載體，并通過ATMT的方法導(dǎo)入稻曲病菌。獲得的2個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子中UVC6TF的表達(dá)分別被抑制了50％和90％，分析它們

4、的產(chǎn)孢量、生長速率等生物學(xué)性狀和致病力檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因不影響菌株正常的生長發(fā)育，但是對(duì)分生孢子的產(chǎn)生過程有一定的調(diào)控作用。產(chǎn)孢能力降低，從而使其致病能力減弱。此外，T-DNA插入還破壞了基因UVRASGAP的表達(dá)，下一步計(jì)劃則是對(duì)單個(gè)基因或是兩個(gè)基因進(jìn)行基因敲除、回補(bǔ)等方法進(jìn)一步研究基因功能，對(duì)稻曲病菌致病過程的解析具有重要意義。
　　2、真菌對(duì)鐵離子的運(yùn)輸有著特殊的機(jī)制。鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)鐵離子的跨膜運(yùn)輸，有時(shí)也可作為二級(jí)

5、調(diào)控影響基因的表達(dá)和機(jī)制，對(duì)保持體內(nèi)鐵離子的平衡和菌株致病因子的產(chǎn)生具有重要意義。Uvt3277是低親和力鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且有研究闡明可能與稻曲病菌的致病過程相關(guān)。本研究則對(duì)基因Uvt3277的功能進(jìn)行進(jìn)一步地驗(yàn)證。構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)沉默載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法(ATMT)導(dǎo)入稻曲病菌中。分析沉默轉(zhuǎn)化子的表型，來驗(yàn)證低鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在稻曲病菌的生長發(fā)育、致病性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默菌株的生長速率與野生菌株P(guān)1相比有一定的降低，但基因沉默效率與生長速

6、率之間沒有明顯的線性關(guān)系，說明基因Uvt3277可能協(xié)同其他調(diào)控因子影響稻曲病菌的生長發(fā)育。鐵脅迫性測定發(fā)現(xiàn)在一定的Fe2+濃度下，沉默菌株能夠利用Fe2+正常生長。另外，沉默菌株的致病能力都比P1強(qiáng)，表明鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一定程度上影響到致病相關(guān)的負(fù)調(diào)控途徑。同時(shí)酵母雙雜交技術(shù)篩選出低鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的互作蛋白，從而進(jìn)一步為稻曲病菌致病機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。但是篩選到的候選蛋白太少，只得到兩個(gè)疑似蛋白:ATP/ADP carrier(AAC)p