煙草T--DNA插入突變體的抗病篩選與大豆疫霉菌PsAAT3的功能研究.pdf

1、煙草經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、種質(zhì)資源豐富、各個(gè)品系間雜交容易、易于遺傳轉(zhuǎn)化，是植物病理學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的模式植物。普通煙為異源四倍體植物，含T和S兩個(gè)基因組，基因組約為4.5 Gb，重復(fù)序列比例高。目前，普通煙草及其兩個(gè)祖先種絨毛狀煙草(N.tomentosiformis)扣林煙草（N.sylvestris）的全基因組序列草圖已經(jīng)繪制完成，這為反向遺傳學(xué)研究煙草基因功能奠定了基礎(chǔ)。煙草突變體庫(kù)的構(gòu)建與篩選是挖掘功能基因最為直接有效的一種主要方法。本研

2、究以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所提供的煙草T-DNA激活標(biāo)簽突變體庫(kù)為材料，創(chuàng)造性地利用兩種化合物對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初篩以彌補(bǔ)抗病表型篩選工作量大的缺點(diǎn)，獲得了一批對(duì)兩種化合物敏感性發(fā)生改變的突變體，并對(duì)其中一個(gè)材料進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　獲得了16個(gè)對(duì)水楊酸敏感性改變的煙草突變體。水楊酸是介導(dǎo)植物抗病性的重要信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)。突變體對(duì)水楊酸處理耐受度改變通常是由于水楊酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)通路關(guān)鍵基因突變引起的，我們對(duì)7776

3、份突變體材料進(jìn)行了初篩、復(fù)篩與表型驗(yàn)證等環(huán)節(jié)，獲得了10個(gè)對(duì)水楊酸耐受性增強(qiáng)的突變體，6個(gè)對(duì)水楊酸更為敏感的突變體。
　　獲得了9個(gè)抗氧化脅迫能力發(fā)生改變的突變體。AT(Amitrole;俗名殺草強(qiáng))是植物過(guò)氧化氫酶的不可逆專一性抑制劑，在生產(chǎn)中被應(yīng)用為內(nèi)吸傳導(dǎo)型滅生性莖葉處理除草劑，通過(guò)葉片和根吸收并在體內(nèi)傳導(dǎo)。因此利用AT處理是篩選抗氧化脅迫突變體簡(jiǎn)單有效的方法，對(duì)其研究也有望獲得抗病關(guān)鍵基因。對(duì)7776份材料進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3

4、個(gè)突變體對(duì)AT耐受性顯著增強(qiáng)，6個(gè)突變體對(duì)AT的敏感性減弱。對(duì)上述獲得的25個(gè)突變體進(jìn)行陽(yáng)性鑒定發(fā)現(xiàn)均為T-DNA插入突變體。接種實(shí)驗(yàn)表明，有多個(gè)的抗病能力發(fā)生改變，這為進(jìn)一步獲得抗病關(guān)鍵基因提供了研究材料。
　　一個(gè)對(duì)AT敏感突變體的抗病性增強(qiáng)。對(duì)編號(hào)為21AS的煙草突變體進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，該突變體對(duì)AT更敏感。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，21AS的葉片呈卵圓形、葉面不平整、葉尖圓鈍。接種灰葡萄孢霉和寄生疫霉兩種病原菌發(fā)現(xiàn)，該突變體抗病性顯

5、著提高。選擇兩個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因(NtGST1和NtCAT1)對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)在侵染過(guò)程中NtGST1呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，NtCAT1下調(diào)表達(dá)，且21AS中兩個(gè)基因的表達(dá)水平高于WT。用flg22處理，觀察到突變體的活性氧積累水平在處理前期明顯下降。有意思的是，我們還發(fā)現(xiàn)一系列的植物細(xì)胞死亡激發(fā)子處理后，細(xì)胞死亡發(fā)生水平明顯降低。上述結(jié)果說(shuō)明該突變體的抗病能力，防衛(wèi)反應(yīng)發(fā)生水平以及抗氧化脅迫能力與野生型相比發(fā)生了明顯改變，但其具體