盾殼霉T-DNA標(biāo)記插入突變體庫(kù)的構(gòu)建及其質(zhì)量評(píng)估.pdf

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生真菌,在世界范圍內(nèi)廣泛存在,是作物菌核病的一種重要生防菌.該論文對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefacien-mediated transformation,ATMT)盾殼霉的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了研究,并對(duì)構(gòu)建的T-DNA標(biāo)記插入體庫(kù)進(jìn)行了評(píng)價(jià).構(gòu)建了用轉(zhuǎn)化的雙元載體,即將來自構(gòu)巢曲霉(Aspergil

2、lus nidulans)的trpC啟動(dòng)子替代用于轉(zhuǎn)化植物的雙元載體pCAMBIA1301中的CaMV 35S啟動(dòng)子,獲得的載體pTFCM,經(jīng)過熱擊導(dǎo)入農(nóng)桿菌EAH105菌株用于轉(zhuǎn)化.實(shí)驗(yàn)證明pTFCM轉(zhuǎn)化循殼霉具有較高的轉(zhuǎn)化效率.通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化盾殼霉條件的探索優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)盾殼霉在生長(zhǎng)17天后所產(chǎn)生的孢子用于轉(zhuǎn)化時(shí)效率明顯提高;孢子濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響較大,用10<'8>個(gè)/ml的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量明顯高于10<'9>個(gè)/m

3、l和10<'7>個(gè)/ml孢子濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的轉(zhuǎn)化子數(shù)量.任意選取10個(gè)轉(zhuǎn)化菌株于PDA上培養(yǎng)6代(無性繁殖),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試的轉(zhuǎn)化子各子代均能在含60μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng),而出發(fā)菌株ZS-1不能生長(zhǎng),說明T-DNA標(biāo)記轉(zhuǎn)化子在遺傳上是穩(wěn)定的.為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子T-DNA插入拷貝數(shù),任意選取58個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因組Southern雜交分析,發(fā)現(xiàn)有48個(gè)菌株為單拷貝,4個(gè)菌株為雙拷貝,另外6個(gè)菌株的實(shí)驗(yàn)沒有結(jié)果,表明單拷貝所占比