橡膠炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)致病相關(guān)突變體表型分析及插入位點定位.pdf

1、橡膠樹炭疽病(Rubber plant anthracnose)主要是由膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc]侵染造成的,是橡膠樹重要的葉部病害之一。構(gòu)建炭疽菌ATMT(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation)轉(zhuǎn)化體庫,鑒定相關(guān)突變體,利用分子生物學(xué)技術(shù)分離和鑒定橡膠樹膠胞炭疽菌的致病相關(guān)基因,是了解其致病機理及互作機制的

2、重要手段。不僅在植物病理學(xué)上有重要意義,而且也為生產(chǎn)上進一步探索新的防病途徑提供線索,為選育持久抗病品種、制定橡膠炭疽病菌持續(xù)管理策略等提供理論依據(jù)。
　　 本研究利用啟動子捕獲技術(shù)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建橡膠炭疽病菌RC-178的突變體庫,使轉(zhuǎn)化子數(shù)目增加到1685個。通過致病力的測定,從該突變體庫中篩選到15個致病力明顯減弱或喪失的突變體。對這15個突變體進行了生物學(xué)特性的觀察分析,發(fā)現(xiàn)2個顏色異常,6個菌落生長緩慢

3、,8個產(chǎn)孢量顯著降低,2個分生孢子形態(tài)異常,2個附著胞形態(tài)異常,3個不能形成附著胞,在洋蔥表皮上侵染釘形成率顯著降低。
　　 對這15個突變體的基因組DNA進行PCR擴增,結(jié)果全部都擴增到潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因序列,而野生型基因組DNA擴增不到,表明突變體的表型變化是由于外源DNA插入所致。采用TAIL-PCR的方法對這15個突變體基因組DNA進行擴增,得到特異擴增片段,并對這些DNA序列進行克隆和測序,獲得3條序列信息

4、,將這些序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast搜索,結(jié)果如下:
　　 突變體T-0900-1的T-DNA插入位點右邊界克隆到1275bp片段,其中950bp-1143bp的134bp與脈孢菌(Neurospora)的一個保守假設(shè)蛋白同源性最高,同時966bp-1143bp的113bp與稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的70-15保守假設(shè)蛋白(MGG_03680)也具有很高同源性。T-0003-3的T-DNA插入位點右邊