柿樹炭疽菌基因組文庫(kù)構(gòu)建及致病性相關(guān)突變體的篩選分析.pdf

1、柿樹炭疽病(Persimmon anthracnose)是由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz.)侵染造成的，在全世界產(chǎn)柿國(guó)家均有發(fā)生。近年來(lái)，隨著浙江省淳安地區(qū)無(wú)核柿(Diospyros kaki cv.Wuheshi)的大面積栽種，柿樹炭疽病趨于嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)病原菌、發(fā)病規(guī)律、致病機(jī)理及與寄主互作機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，然而，許多工作僅局限在細(xì)胞學(xué)水平上。利用分子生物學(xué)技術(shù)分離和鑒定柿樹

2、炭疽菌的致病相關(guān)基因，是了解柿樹炭疽菌致病機(jī)理及互作機(jī)制的重要手段，不僅在植物病理學(xué)上有重要意義，而且也為生產(chǎn)上進(jìn)一步探索新的防病途徑提供線索。因此，本文采用SuperCosl載體構(gòu)建了基因組文庫(kù)，同時(shí)用(Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation)ATMT技術(shù)進(jìn)行了柿樹炭疽菌的轉(zhuǎn)化，并對(duì)致病性相關(guān)的基因進(jìn)行了克隆。 1基因組文庫(kù)構(gòu)建采用SuperCos1載體構(gòu)建了膠孢炭疽

3、菌基因組文庫(kù)。建立了SDS及蛋白酶K提取高質(zhì)量基因組DNA的方法，酶切可獲得大小約40 kb DNA片段。片段被連接和包裝后，轉(zhuǎn)染XL1-BlueMR細(xì)菌，最終獲得4.0×104個(gè)粘?？寺?每微克基因組DNA約產(chǎn)生105個(gè)粘?？寺?。它們混合在15％甘油中，保存于-70℃條件下。通過(guò)對(duì)50個(gè)隨機(jī)重組子分析表明，98％的重組子克隆中含有外源DNA片段，平均大小為40.5 kb。按照膠孢炭疽菌基基因組DNA為50 Mb計(jì)算，庫(kù)容量已高達(dá)31

4、.75，理論上從該文庫(kù)中篩選到任一DNA序列的精確概率高達(dá)99.9％。對(duì)擴(kuò)增保存后文庫(kù)菌液滴度測(cè)定顯示，該文庫(kù)滴度約為4.6×108 cfu/ml。當(dāng)進(jìn)行3次反復(fù)凍融后，其滴度仍可達(dá)4.0×108 cfu/ml。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的粘粒基因組文庫(kù)質(zhì)量比較高，符合篩選目的基因的要求。 2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柿樹炭疽菌轉(zhuǎn)化及突變體篩選本試驗(yàn)中，首先將構(gòu)建的雙元載體pATMT1通過(guò)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-l中，然后AGL-1菌液與800μl

5、的1×106/ml柿樹炭疽菌TSG001分生孢子在乙酰丁香酮(AS)的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)兩輪hyg抗性篩選后共獲得787個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)900轉(zhuǎn)化子/106個(gè)分生孢子。對(duì)隨機(jī)挑選的14個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證表明，含有T-DNA的轉(zhuǎn)化子比率達(dá)92.8％。通過(guò)表型分析，篩選出22個(gè)生長(zhǎng)速度變異的轉(zhuǎn)化子，30個(gè)菌落顏色變化的轉(zhuǎn)化子，32個(gè)產(chǎn)孢能力減弱的轉(zhuǎn)化子和18個(gè)孢子形態(tài)變異的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)致病性試驗(yàn)測(cè)定，獲得5個(gè)弱致病性和6個(gè)無(wú)致病

6、性轉(zhuǎn)化子。 3 無(wú)致病性突變體分析生物學(xué)特性分析進(jìn)一步對(duì)6個(gè)無(wú)致病性突變體進(jìn)行分析，Cg-10、Cg-32、Cg-305、Cg-573、Cg-608和Cg-613與野生型TSG001生長(zhǎng)速度均存在顯著性差異，在菌落形態(tài)及顏色方面也存在較為明顯的變異。6個(gè)轉(zhuǎn)化子中，產(chǎn)孢量均顯著低于TSG001菌株(187.5×106孢子/皿)，其中，Cg-10、Cg-32、Cg-305和Cg-608產(chǎn)孢量均不到野生型產(chǎn)孢量的1/100；同時(shí)6個(gè)轉(zhuǎn)

7、化子分生孢子形態(tài)之間也存在較大差異。除Cg-608孢子萌發(fā)率(80％)及附著孢形成率(75％)與野生型TSG001無(wú)顯著差異外，其余5個(gè)突變體均顯著低于野生型。其中，Cg-32及Cg-613的分生孢子萌發(fā)率僅為2％，Cg-613附著孢形成率更是僅為1％，而突變體Cg-32在整個(gè)孢子萌發(fā)試驗(yàn)中未見任何附著孢產(chǎn)生。 T-DNA插入拷貝數(shù)鑒定 Southern雜交結(jié)果顯示，突變體Cg-305為3拷貝突變體，Cg-608為雙拷貝突變體，

8、其它4個(gè)突變體Cg-1O、Cg-32、Cg-573、Cg-613均為T-DNA單拷貝插入。 單拷貝無(wú)致病性突變體側(cè)翼序列分析根據(jù)T-DNA插入序列設(shè)計(jì)引物，采用反向PCR、TAIL-PCR及高效TAIL-PCR擴(kuò)增出Cg-10和Cg-32的左右臂側(cè)翼序列及Cg-613的右臂側(cè)翼序列。通過(guò)序列編輯并進(jìn)行Blastn搜索，結(jié)果表明，三個(gè)無(wú)致病性突變體Cg-10、Cg-32和Cg-613 T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分別與24-C甲基轉(zhuǎn)