柿樹炭疽菌基因組文庫構(gòu)建及致病性相關(guān)突變體的篩選分析.pdf

1、柿樹炭疽病(Persimmon anthracnose)是由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz.)侵染造成的，在全世界產(chǎn)柿國家均有發(fā)生。近年來，隨著浙江省淳安地區(qū)無核柿(Diospyros kaki cv.Wuheshi)的大面積栽種，柿樹炭疽病趨于嚴重。本實驗室已對病原菌、發(fā)病規(guī)律、致病機理及與寄主互作機制進行了系統(tǒng)研究，然而，許多工作僅局限在細胞學水平上。利用分子生物學技術(shù)分離和鑒定柿樹

2、炭疽菌的致病相關(guān)基因，是了解柿樹炭疽菌致病機理及互作機制的重要手段，不僅在植物病理學上有重要意義，而且也為生產(chǎn)上進一步探索新的防病途徑提供線索。因此，本文采用SuperCosl載體構(gòu)建了基因組文庫，同時用(Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation)ATMT技術(shù)進行了柿樹炭疽菌的轉(zhuǎn)化，并對致病性相關(guān)的基因進行了克隆。 1基因組文庫構(gòu)建采用SuperCos1載體構(gòu)建了膠孢炭疽

3、菌基因組文庫。建立了SDS及蛋白酶K提取高質(zhì)量基因組DNA的方法，酶切可獲得大小約40 kb DNA片段。片段被連接和包裝后，轉(zhuǎn)染XL1-BlueMR細菌，最終獲得4.0×104個粘?？寺?每微克基因組DNA約產(chǎn)生105個粘?？寺?。它們混合在15％甘油中，保存于-70℃條件下。通過對50個隨機重組子分析表明，98％的重組子克隆中含有外源DNA片段，平均大小為40.5 kb。按照膠孢炭疽菌基基因組DNA為50 Mb計算，庫容量已高達31

4、.75，理論上從該文庫中篩選到任一DNA序列的精確概率高達99.9％。對擴增保存后文庫菌液滴度測定顯示，該文庫滴度約為4.6×108 cfu/ml。當進行3次反復(fù)凍融后，其滴度仍可達4.0×108 cfu/ml。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的粘?；蚪M文庫質(zhì)量比較高，符合篩選目的基因的要求。 2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柿樹炭疽菌轉(zhuǎn)化及突變體篩選本試驗中，首先將構(gòu)建的雙元載體pATMT1通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-l中，然后AGL-1菌液與800μl

5、的1×106/ml柿樹炭疽菌TSG001分生孢子在乙酰丁香酮(AS)的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。經(jīng)過兩輪hyg抗性篩選后共獲得787個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率高達900轉(zhuǎn)化子/106個分生孢子。對隨機挑選的14個轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證表明，含有T-DNA的轉(zhuǎn)化子比率達92.8％。通過表型分析，篩選出22個生長速度變異的轉(zhuǎn)化子，30個菌落顏色變化的轉(zhuǎn)化子，32個產(chǎn)孢能力減弱的轉(zhuǎn)化子和18個孢子形態(tài)變異的轉(zhuǎn)化子。通過致病性試驗測定，獲得5個弱致病性和6個無致病

6、性轉(zhuǎn)化子。 3 無致病性突變體分析生物學特性分析進一步對6個無致病性突變體進行分析，Cg-10、Cg-32、Cg-305、Cg-573、Cg-608和Cg-613與野生型TSG001生長速度均存在顯著性差異，在菌落形態(tài)及顏色方面也存在較為明顯的變異。6個轉(zhuǎn)化子中，產(chǎn)孢量均顯著低于TSG001菌株(187.5×106孢子/皿)，其中，Cg-10、Cg-32、Cg-305和Cg-608產(chǎn)孢量均不到野生型產(chǎn)孢量的1/100；同時6個轉(zhuǎn)

7、化子分生孢子形態(tài)之間也存在較大差異。除Cg-608孢子萌發(fā)率(80％)及附著孢形成率(75％)與野生型TSG001無顯著差異外，其余5個突變體均顯著低于野生型。其中，Cg-32及Cg-613的分生孢子萌發(fā)率僅為2％，Cg-613附著孢形成率更是僅為1％，而突變體Cg-32在整個孢子萌發(fā)試驗中未見任何附著孢產(chǎn)生。 T-DNA插入拷貝數(shù)鑒定 Southern雜交結(jié)果顯示，突變體Cg-305為3拷貝突變體，Cg-608為雙拷貝突變體，

8、其它4個突變體Cg-1O、Cg-32、Cg-573、Cg-613均為T-DNA單拷貝插入。 單拷貝無致病性突變體側(cè)翼序列分析根據(jù)T-DNA插入序列設(shè)計引物，采用反向PCR、TAIL-PCR及高效TAIL-PCR擴增出Cg-10和Cg-32的左右臂側(cè)翼序列及Cg-613的右臂側(cè)翼序列。通過序列編輯并進行Blastn搜索，結(jié)果表明，三個無致病性突變體Cg-10、Cg-32和Cg-613 T-DNA插入位點側(cè)翼序列分別與24-C甲基轉(zhuǎn)