水稻T-DNA插入突變體側(cè)翼序列的分離與分析及控制雜合單株低育性基因Osfbox的功能研究.pdf

1、創(chuàng)造基因功能缺失突變體是研究目的基因功能的最直接和有效的途徑之一。農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入不僅破壞了插入位點的基因功能，而且因為T-DNA序列已知，使得被破壞的基因序列的分離相對簡單和快捷。農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化還因其在水稻基因組中相對隨機的分布規(guī)律，成熟的轉(zhuǎn)化體系，穩(wěn)定的后代遺傳，簡單的遺傳背景，被廣泛地用于水稻插入突變體庫的構(gòu)建。 T-DNA側(cè)翼序列的分離對水稻T-DNA插入突變體庫的應用至關(guān)重要。一方面，我們可以根據(jù)

2、大量的T-DNA側(cè)翼序列來分析T-DNA在水稻基因組中的分布規(guī)律，進而明晰農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化機制；另一方面，根據(jù)側(cè)翼序列提供的基因信息，我們可以廣泛地開展反向遺傳學的研究。本研究中，我們采用PCR擴增對突變體的陽性情況進行了檢測，利用TAIL-PCR的方法成功地分離T-DNA側(cè)翼序列，分析了T-DNA在水稻基因組中的分布規(guī)律，揭示了T-DNA插入位點序列的DNA物理特性和堿基組成特征。根據(jù)已有的側(cè)翼序列，我們還開展了反向遺傳學的

3、研究，得到了一個雜合低育性的突變體，在細胞學水平觀察了突變體敗育的原因，并對控制突變性狀的候選目標基因Dsfbox的功能進行了詳細的分析，主要研究結(jié)果如下： 1.以T-DNA上的GAL4/VP16基因區(qū)段為標記，對9024個轉(zhuǎn)基因植株DNA進行了PCR擴增陽性檢測，擴增結(jié)果表明7862為PCR陽性，陽性率為87.1％。 2.利用TAIL-PCR的方法，本文成功的分離得到了5100條水稻T-DNA側(cè)翼序列，其中2609條可

4、以準確的定位在水稻基因組上，定位率為51.2％。聯(lián)合課題組其它五位同學的側(cè)翼序列，課題組共有側(cè)翼序列30577條，定位率為51.5％。 3.無論是從T-DNA標簽的絕對數(shù)量還是相對密度來看，T-DNA都偏愛于插入到水稻中長度較大的染色體上，且插入密度與染色體大小顯著正相關(guān)(r=0.74，P<0.01)。在同一染色體上，T=DNA的分布更傾向于插入到遠離著絲粒的染色體末端，且與染色體區(qū)段上的全長cDNA數(shù)目顯著相關(guān)(r=0.70，

5、P<0.01)。T-DNA在水稻基因組中極度地偏向于不插入到轉(zhuǎn)座子相關(guān)序列中(SR=-34.0)。在水稻的基因區(qū)域中，我們發(fā)現(xiàn)T-DNA偏愛于插入到上游1kb區(qū)(SR=12.8)和下游500bp區(qū)(SR=10.3)而趨向于不插入到編碼區(qū)(SR=-13.2)。但在基因的編碼區(qū)內(nèi)，我們并沒有發(fā)現(xiàn)T-DNA在外顯子和內(nèi)含子之間存在偏愛性(χ2=2.81，P=0.09)。 4.T-DNA在不同“分子功能”的基因中同樣也存在著分布的偏愛性

6、(χ2=93.5，P<0.000001)：偏向于插入到“Antioxidant”(SR=6.07)和“Catalytic”(SR=3.79)兩類功能基因中，偏向于不插入到“Nutrientreservoir”，“Enzymeregulator”,“Transcriptionregulator”和“Ligandbindingandcarrier”(SR值介于-2.1到-3.8)，而在其它的五類功能基因中基本上呈一種隨機分布的狀態(tài)。

7、 5.本文分析了本室和來源于其它三家研究單位的水稻T-DNA插入位點前后各1kb(共2001bp)序列(ISNS)的彎曲度的平均值，并以隨機提取的2000條長度在2001bp的序列作為對照。彎曲度圖的結(jié)果顯示：隨機序列的彎曲度值表現(xiàn)為雜亂的曲線。而本室提取的ISNS的彎曲度圖中我們可以看到在序列的-200bp到200bp這一序列區(qū)間內(nèi)彎曲度值出現(xiàn)了一個明顯的波型變化，在-200和200位置為波谷。最大值波峰分別出現(xiàn)在約-10和10的位置

8、。且在0，即T-DNA插入位點陡然的下降出現(xiàn)一個相對低值。在其它研究單位提取的ISNS中我們同樣觀察到了同樣的現(xiàn)象。 6.對不同ISNS的GC含量分析后我們認為GC含量的高低不是T-DNA插入位點的主要特征。但對ISNS和隨機提取序列的GCskew和TAskew分析發(fā)現(xiàn)：兩組ISNS的GC與TAskews之間呈顯著的負相關(guān)(r>-0.92)。GC與TAskew曲線在插入位點位置出現(xiàn)交叉，且兩種skew的值在插入位點都約為0；在-

9、800到0的這段序列里，GCskew值表現(xiàn)為正值，且在-200到-100位置達到最大值，與之對應的是TAskew值為負值，但也是在同樣位置達到最小值；在0-800區(qū)域內(nèi)我們也發(fā)現(xiàn)了對應的結(jié)果，GCskew值表現(xiàn)為負值，TAskew值表現(xiàn)為正值，且在200到100位置堿基的分布出現(xiàn)極度的不均衡情況。在對照序列的結(jié)果中并沒有發(fā)現(xiàn)這些特征。 7.在本文的T-DNA插入群體中，同一插入位點的T-DNA串連重復普遍存在，正向重復，頭對頭反

10、向重復和尾對尾反向重復的比例分別達到了19.9％，10.5％和25.4％，40.9％的單株中至少存在著一種以上的串連重復形式：載體骨架序列帶入到水稻基因組中的情況同樣突出，左右邊界帶入的載體骨架序列單株比例分別達到了49.6％和29.7％。 8.對一個T-DNA插入位點位于第六染色體上的f-box基因3’UTR內(nèi)的突變體開展了反向遺傳學的研究，發(fā)現(xiàn)T-DNA雜合單株表現(xiàn)為半不育，但T-DNA陰性和純合單株均育性正常，類似于水稻秈

11、粳亞種間雜種不育。PCR擴增結(jié)果顯示突變表型與T-DNA插入位點滿足嚴格的共分離關(guān)系。目標基因被命名為Osfbox。 9.Osfbox在TIGR中的編號為LOC_Os06g06050，基因全長4441bp。KOME提供了該基因的全長cDNA信息(AK065478)：cDNA的總長度為3723bp，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，編碼一個包含720個氨基酸的蛋白，在第15-63氨基酸位置存在一個F-boxdomain，390-469

12、氨基酸位置為Cysteine-containingLRRprofile結(jié)構(gòu)域。 10.細胞學觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌雄配子發(fā)育的受阻共同導致了T-DNA雜合單株的低育性。我們在小孢子的四分體時期開始發(fā)現(xiàn)絨氈層的降解出現(xiàn)了滯后。大、均能通過減數(shù)分裂時期，但在隨后的有絲分裂過程中受阻，最小孢子母細終導致敗育。 11.對10個典型的水稻秈粳品種的Osfbox基因的序列比對結(jié)果表明在秈粳品種之間的堿基變異共有18處，其中12處發(fā)生在基因轉(zhuǎn)

13、錄起始位點的前648bp范圍內(nèi)。在基因的編碼區(qū)，我們只發(fā)現(xiàn)了粳稻基因型存在2處缺失，導致兩個位點粳稻的氨基酸序列分別產(chǎn)生了3個串連谷氨酸和1個甘氨酸的缺失。 12.全生育期表達譜芯片和RT-PCR結(jié)果顯示Osfbox是一個組成型表達基因，在雌雄蕊中的表達量稍高。RT-PCR的結(jié)果還表明在三到八期幼穗中，四期的幼穗中Osfbox的表達量達到最高，爾后隨著時間的推移逐步減弱。原位雜交的結(jié)果也顯示直至小孢子母細胞形成四分體，Osfbo