釀酒酵母ARS側翼序列對其復制活性的影響.pdf

1、細胞在增殖過程中最重要過程的是其間期的DNA復制。他受到多方面的因素影響。其中其復制起點對其影響尤為重要,它的異常可能會導致癌癥等多種疾病的產生。而酵母作為模式生物之一,它有著真核生物和原核生物雙重特點,是作為研究復制起始位點的優(yōu)良實驗材料。酵母復制的起始位點稱為自主復制序列(ARS),其III號染色體上的ARS約有19個,其使用頻率各不相同,通過高通量的核小體定位發(fā)現(xiàn),在ARS側翼上出現(xiàn)核小體的分布各有不同,由此可見ARS兩側序列可能

2、會影響ARS的活性。
　　本實驗通過PCR擴增酵母III號染色體上的ARS304、ARS305及其側翼序列。并以整合型載體pRS405為基礎構建重組質粒PARS304,PARS304-500,PARS304-2000。為了鑒定ARS304、ARS305不同側翼序列對釀酒酵母的自主復制活性的影響,將構建好的重組質粒以及本實驗室原有保存的載體PARS305,PARS305-500,PARS305-2000通過電轉化方法轉化至釀酒酵母細

3、胞。酵母感受態(tài)細胞為缺陷型細胞,pRS405載體上含有亮氨酸標記但必須整合到酵母基因組上才能表達,而由于搭載有ARS序列的載體可以游離于基因組之外獨立表達合成亮氨酸,所以通過驗證其轉化子個數,從而計算轉化頻率。在此過程中對電轉化進行條件優(yōu)化,通過均勻設計對電場強度、外源DNA量和酵母生長狀態(tài)對電轉化的影響。當電場強度在1750V,酵母OD值在1.3,外源DNA量在600ng時,轉化率最高。在此條件下測定質粒丟失率。經計算PARS304轉

4、化率為389-412轉化子/μg,質粒每代的丟失率為16.2％;PARS305轉化率為523-551轉化子/μg質粒,每代的丟失率為11.2%;PARS304-500轉化率為476-497轉化子/μg質粒,每代的丟失率為14.7%;PARS305-500轉化率為723-734轉化子/μg質粒;每代的丟失率為9.01%,PARS304-2000轉化率為623-632轉化子/μg質粒,每代的丟失率為9.35%;PARS305-2000轉化率

5、為929-939轉化子/μg,質粒每代的丟失率為8.1%。這說明構建的重組質粒在酵母中都是不穩(wěn)定的,都可以進行自主復制。且ARS305及其側翼序列轉化率高于ARS304,隨著側翼序列的增長其自主復制活性增高。
　　本實驗后續(xù)工作在PARS-500,PARS-1000,PARS-2000。重組質粒上組裝核小體,研究重組質粒上核小體的分布及核小體定位對復制起始活性的影響,為以酵母作模式生物研究真核基因的復制與轉錄機制提供了有益的線索。