釀酒酵母新DNA復(fù)制起始蛋白的篩選、鑒定及其功能的研究.pdf

1、隨著對(duì)DNA復(fù)制起始蛋白及其調(diào)控因子研究的不斷深入，人們對(duì)DNA復(fù)制起始調(diào)控機(jī)理的了解也越來越透徹，但詳細(xì)的調(diào)控模式仍不清楚，有待通過尋找更多的新復(fù)制起始蛋白或調(diào)控因子來加以闡明。本研究以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)為研究對(duì)象，運(yùn)用兩種不同的篩選策略來尋找新的DNA復(fù)制起始蛋白：一種是本聯(lián)合研究室創(chuàng)立的全面篩選新DNA復(fù)制起始蛋白的方法-IDR(Initiation of DNA Replication)篩

2、選，通過甲基磺酸乙酯(EMS)誘變酵母細(xì)胞、轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(p1ARS與p8ARSs)鑒定復(fù)制起始突變體及基因組文庫(kù)的基因互補(bǔ)挽救等幾步篩選，鑒定得到兩個(gè)新的DNA復(fù)制起始蛋白——Ctf4p與Adk1p。Ctf4p(Chromosome Transmission Fidelity4)已知參與粘粒(Cohesion)的建立與DNA復(fù)制的控制，但未有其參與DNA復(fù)制起始過程的報(bào)道；Adk1p是一種腺苷酸激酶(Adenylate Kinase)，主

3、要作用是維持細(xì)胞內(nèi)腺苷酸水平的穩(wěn)定。另一種篩選方法是以DNA復(fù)制起始蛋白Noc3p為“誘餌(bait)”蛋白，利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)從酵母cDNA文庫(kù)中篩選與Noc3p相互作用的蛋白，篩選得到2,600個(gè)與Noc3p相互作用的文庫(kù)質(zhì)粒(1,100個(gè)表現(xiàn)強(qiáng)的相互作用，1,500個(gè)表現(xiàn)弱的相互作用)，其中有6個(gè)新蛋白(Srp1p、Tdh3p、Cdc19p、Eno1p、Eno2p及Tma19p)被鑒定出來。
　　 本研究對(duì)篩選到的兩個(gè)新D

4、NA起始候選蛋白Ctf4p與Adk1p進(jìn)行了深入研究。突變株W10(ctf4-idr)具有典型的復(fù)制起始缺陷(idr)表型：可造成p1ARS每代10.27％的丟失率(高丟失)而p8ARSs2.94％的丟失率(中等丟失)，表明突變后的Ctf4p以一種與復(fù)制區(qū)(Autonomously replicating sequence，ARS)直接的或間接的作用而影響了質(zhì)粒DNA復(fù)制起始的穩(wěn)定性。對(duì)CTF4缺失及過量表達(dá)后細(xì)胞的溫度敏感性與DNA損

5、傷的藥物(HU)敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CTF4是一溫度依賴的必需基因(CTF4缺失后細(xì)胞在37℃不能生長(zhǎng)，但能在25℃正常生長(zhǎng))；Ctf4p被誘導(dǎo)過量表達(dá)后的DNA損傷表型比ctf4△表現(xiàn)更敏感，并使菌株產(chǎn)生一定的idr表型。對(duì)溫度敏感株GAL-ctf4-td在細(xì)胞周期不同時(shí)間(G1期、S期及G2/M期)的同步化、Ctf4p-td降解、釋放并進(jìn)行DNA含量的流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，Ctf4p-td的降解會(huì)使DNA復(fù)制延遲起始進(jìn)入S期，但不會(huì)影響

6、DNA復(fù)制的延伸與有絲分裂的進(jìn)行。細(xì)胞周期的染色質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Ctf4p結(jié)合染色體是依賴于細(xì)胞周期的調(diào)控的。酵母雙雜交、免疫共沉淀及合成致死的實(shí)驗(yàn)表明，Ctf4p不僅與復(fù)制前期復(fù)合物(pre-replication complex，pre-RC)組裝的必需蛋白有物理上的相互作用(Cdt1p)及遺傳上的相互作用(Mcm2p與Mcm5p)，還與pre-RC的激活蛋白有物理上與遺傳上的相互作用(Mcm10p與Pol1p);另外Cdt1p和Sl

7、d5p分別與Ctf4p的兩段結(jié)構(gòu)域(C端部分與N端部分)都有相互作用，而Mcm10p和Pol1p分別只與N端部分和C端部分有相互作用。研究還發(fā)現(xiàn)GINS與Pol1p有物理上的相互作用，它們可能與Ctf4p及Mcm10p一起組成一個(gè)復(fù)合物來調(diào)控DNA復(fù)制的起始。
　　 突變株F1(adk1-idr)也具有顯著的idr表型：可造成p1ARS每代2.56％的丟失率(中等丟失)而p8ARSs每代0.539％的丟失率(低丟失)，表明突變了

8、的Adk1p以一種與ARS直接的或間接的作用而影響了質(zhì)粒DNA復(fù)制起始的穩(wěn)定性。對(duì)ADK1缺失后細(xì)胞的溫度敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ADK1是一溫度依賴的必需基因(表現(xiàn)為細(xì)胞在37℃不能生長(zhǎng)而在25℃能正常生長(zhǎng));Adk1p部分結(jié)構(gòu)缺失(Lid△與Ct△)及突變(K19E)后的表型與adk1△的一致，這可能是由于Adk1p的這些氨基酸的缺失或突變破壞了Adk1p的酶活性造成的。對(duì)突變株adk1-td在細(xì)胞周期不同時(shí)間(G1期、S期及G2/M期)的

9、同步化、Adk1p-td降解、釋放并進(jìn)行DNA含量的流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，Adk1p-td的降解會(huì)使DNA復(fù)制不能起始進(jìn)入S期，但不會(huì)影響DNA復(fù)制的延伸與有絲分裂的進(jìn)行。“七組分”染色質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)及細(xì)胞周期的染色質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，Adk1p在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)都結(jié)合在染色體上。酵母雙雜交與免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到Adk1p與pre-RC蛋白(ORC、Cdc6p、Cdt1p及MCM)之間有物理上的相互作用。已知復(fù)制起始基因的溫度敏感變株及idr

10、突變株的多拷貝的校正實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)Adk1p與pre-RC蛋白之間有遺傳上的相互作用，但發(fā)現(xiàn)Adk1p與NTP代謝過程中尿苷酸激酶Ura6p(Uridylate Kinase)有遺傳上的相互作用：表現(xiàn)為F1的idr表型可以被高拷貝的URA6挽救，但不能被所檢測(cè)的其它參與調(diào)控NTP或dNTP水平的激酶或蛋白的相應(yīng)高拷貝基因(YUK1、CDC8、YNK1、YCF1、ATP16、SML1及RNR1-4)所挽救。idr菌落大小的表型實(shí)驗(yàn)表明溫度敏感