釀酒酵母Ssz1蛋白新功能的研究.pdf

1、目的：過表達(dá)SSZ1能夠抑制酵母（scj1-1Δire1）的溫度敏感生長表型和恢復(fù)酵母（Δscj1Δire1）的生長致死效應(yīng)。說明在過表達(dá)的情況下，SSZ1可能行使了不同于以往報道的細(xì)胞功能。利用過表達(dá)SSZ1給酵母帶來的基因表達(dá)譜變化，預(yù)測過表達(dá)SSZ1行使的細(xì)胞功能，并通過實驗進(jìn)一步確證。另外，還探究了SSZ1結(jié)構(gòu)域變化對其行使細(xì)胞新功能的影響。本項研究可加深對SCJ1基因功能和UPR機(jī)制的理解。
　　方法：使用Primer

2、premier5.0軟件設(shè)計SSZ1結(jié)構(gòu)域缺失突變體引物，選取帶TDH3強(qiáng)啟動子的穿梭載體，經(jīng)PCR擴(kuò)增，純化，酶切和連接，構(gòu)建SSZ1結(jié)構(gòu)域缺失突變體載體，并測序鑒定；將構(gòu)建的載體分別轉(zhuǎn)入野生型（W303）和溫度敏感型（scj1-1Δire1）酵母，利用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法檢測過表達(dá)SSZ1突變體基因?qū)σ吧徒湍缚顾幮缘挠绊懞蛯囟让舾行徒湍笢囟让舾行?yīng)的影響；將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入顏色分離酵母，利用劃線培養(yǎng)法觀察酵母生長的顏色，驗證過表達(dá)SSZ

3、1突變體基因是否具有完整的SSZ1細(xì)胞新功能。利用在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測SSZ1結(jié)構(gòu)域缺失突變體的蛋白結(jié)構(gòu)，分析可能存在的細(xì)胞新功能的核心結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用DNA microarray技術(shù)，獲得過表達(dá)SSZ1給酵母帶來的基因表達(dá)譜變化，通過差異表達(dá)基因的聚類分析，GO富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測SSZ1基因可能的細(xì)胞功能，并通過生化實驗驗證其細(xì)胞功能。采用基因克隆，對篩選到的差異基因進(jìn)行載體構(gòu)建，通過連續(xù)稀釋培養(yǎng)法驗證差異表達(dá)基

4、因的細(xì)胞功能。最后，我們還對差異表達(dá)基因中涉及PDR通路，UPR通路，CWI通路的相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，從表達(dá)水平上確認(rèn)過表達(dá)SSZ1與這三種通路的關(guān)系。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建7個SSZ1缺失突變表達(dá)載體；（2）SSZ1突變體SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-200，Δ2-240，Δ2-303，Δ2-372，Δ2-402轉(zhuǎn)入野生型酵母中，不具有抗藥性；（3）SSZ1突變體SSZ1Δ2-200，Δ2-240，Δ2-37

5、2，Δ2-402有抑制溫度敏感型酵母生長表型的功能，相反的，SSZ1突變體SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-303，不具有抑制功能；（4）顏色分離酵母實驗顯示，SSZ1Δ2-200，Δ2-240，Δ2-372，Δ2-402有紅白相間的菌落出現(xiàn)，表明它們可能具有與完整SSZ1相同的細(xì)胞新功能。SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-303則沒有紅白相間的菌落出現(xiàn)；（5）轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析結(jié)果顯示過表達(dá)SSZ1能誘導(dǎo)升高多向耐藥性通路（P

6、DR）的相關(guān)基因，不誘導(dǎo)升高未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的靶基因，過表達(dá)SSZ1還能夠上調(diào)細(xì)胞壁完整性信號通路（CWI）相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子RSC30的表達(dá)；（6）完成多個差異表達(dá)基因的克隆并驗證其細(xì)胞功能。PDR1，PDR5，RHO1，SMP1，KDX1不具有抑制酵母（scj1-1Δire1）溫度敏感表型的功能。1M滲透壓穩(wěn)定劑山梨醇能夠抑制（scj1-1Δire1）酵母溫度敏感表型而且RSC30有抑制酵母（scj1-1Δire1）溫度敏感

7、表型的功能。
　　結(jié)論：過表達(dá)SSZ1具有維持酵母細(xì)胞穩(wěn)健性（Cellular robustness）的新功能。Ssz1p結(jié)構(gòu)域與其新功能有密切關(guān)系，Ssz1p的403-538位氨基酸是其新功能所必需的，另外，存在2個促進(jìn)和2個抑制新功能發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)域，它們分別是：2-40，241-303和116-200，304-372；SSZ1新功能不通過PDR通路和UPR通路，而是通過提高細(xì)胞壁的完整性，但是結(jié)果顯示過表達(dá)SSZ1的新功能不