GDH1缺失型釀酒酵母的構(gòu)建.pdf

1、微生物發(fā)酵菌種一直是燃料乙醇工業(yè)發(fā)展的瓶頸。利用生物質(zhì)資源水解產(chǎn)物規(guī)模化生產(chǎn)燃料乙醇，選育發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母是關(guān)鍵技術(shù)。發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母能夠縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵醪酒精濃度，提高發(fā)酵效率，降低發(fā)酵成本，以達(dá)到解決當(dāng)前生物質(zhì)原料低成本大規(guī)模生產(chǎn)燃料乙醇的目的。各國科學(xué)家在不同階段，選用不同技術(shù)手段，開展選育發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母的研究。當(dāng)前，以DNA重組技術(shù)改造釀酒酵母，通過代謝途徑的擴(kuò)展以及轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑的研究引起了學(xué)

2、者們的極大興趣。 在釀酒酵母細(xì)胞代謝過程中，釀酒酵母產(chǎn)生乙醇的代謝途徑與甘油生成代謝途徑是相關(guān)聯(lián)的，甘油代謝途徑能維持發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的NAD+/NADH平衡。在整個(gè)乙醇發(fā)酵過程中生成甘油的碳源耗損為整個(gè)碳源消耗的4％--10％，使甘油成為釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中主要的副產(chǎn)物之一。從乙醇代謝途徑出發(fā)，降低甘油代謝提高乙醇產(chǎn)量的研究引起了學(xué)者的極大興趣，構(gòu)建消耗NADH的代謝流是研究釀酒酵母發(fā)酵糖類生產(chǎn)乙醇的一條有效途徑。釀酒酵母

3、基因組中GDH1編碼的NADPH依賴型的谷氨酸脫氫酶(Gdhlp)催化2-酮戊二酸生成谷氨酸，同時(shí)它還存在存在一個(gè)同工酶----GDH2編碼的NADH依賴的谷氨酸脫氫酶(Gdh2p)，催化的反應(yīng)正好和Gdhlp催化的相反。在釀酒酵母中，還存在另一條由GLT1編碼的NADH依賴型谷氨酸合酶和GLN J編碼的谷氨酰氨合酶催化的谷氨酸代謝途徑，它們能催化NADH和ATP生成NAD+和ADP。通過對釀酒酵母GDH1基因的敲除，消除谷氨酸代謝途徑

4、對輔酶II (NADPH)依賴，使其專一性的依賴于輔酶I(NADH)進(jìn)行代謝，從而降低甘油途徑的代謝壓力，改變酵母細(xì)胞中NADH的代謝流，以期減少釀酒酵母發(fā)酵過程中的甘油生成，增加碳流向生成乙醇方向的轉(zhuǎn)化，提高釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的生成量。 本文以雙倍體釀酒酵母SS04出發(fā)，采用Cre/LoxP系統(tǒng)基因敲除法對GDH1基因進(jìn)行基因敲除操作，構(gòu)建GDH1突變型菌株，進(jìn)行了生長特性測定和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對工業(yè)釀酒酵母的基因敲除工程育種技術(shù)

5、的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。文章主要研究了如下幾個(gè)方面： 1.采用LoxP-Kan-LoxP序列組件和Cre/LoxP系統(tǒng)基因挽救原理敲除酵母的GDH1基因。根據(jù)釀酒酵母GDH1的ORF以及其上下游的一段序列設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物A、B、C、D，引物位置分別在ORF的上游序列上、GDH1的ORF上、ORF的下游序列上。根據(jù)pUG6的序列設(shè)計(jì)一個(gè)敲除組件引物R1、R2，它們5，端分別是GDH1開放讀碼框的上游和下游的45bp序列，用來同源重組

6、，3'端分別是19bp和22bp的堿基序列，與質(zhì)粒pUG6中LoxP-Kan-LoxP基因兩側(cè)的某段序列互補(bǔ)。以R1、R2為引物，以pUG6質(zhì)粒為模板，用PCR的方法獲得帶有LoxP-Kan-LoxP的敲除組件R1-R2。以Kan的ORF為基礎(chǔ)，在其上設(shè)計(jì)引物KB、KC，分別與引物A、D組成引物對A-KB、KC-D，用于驗(yàn)證敲除組件是否正確重組進(jìn)酵母基因組的GDH1位置。以課題組篩選的釀酒酵母SS04為出發(fā)菌株，醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化敲除

7、組件R1-R2至菌株SS04，同源重組后的菌落能在含G418的YPD平板上生長，挑取這些菌落并提取DNA，PCR驗(yàn)證正確重組了R1-R2的菌落。轉(zhuǎn)化pSH65至上述陽性菌株中，在YPG液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生Cre酶，Cre能識別LoxP位點(diǎn)序列并切除LoxP之間的序列和后面一個(gè)LoxP序列，在原位置僅留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)。影印平板法篩選，那些能在YPD平板上生長而不能在含有G418平板上生長的菌落可能就是正確的重組子，PCR驗(yàn)證正確切除了

8、抗性標(biāo)記的菌株，傳代丟失pSH65，得到了一株GDH1的一個(gè)等位基因缺失的酵母菌株SS15。從SS15出發(fā)，再次按上述步驟敲除另一個(gè)GDH1等位基因，并用設(shè)計(jì)好的驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得GDH1基因完全突變的酵母菌株SS17。菌株SS17原GDH1基因位置僅留下一段LoxP位點(diǎn)序列，沒有編碼異源蛋白的抗性篩選標(biāo)記基因，適用于工業(yè)生產(chǎn)使用菌株的構(gòu)建，降低了外來基因的生物危害。 2.乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SS04、SS15、SS17

9、三株菌株的發(fā)酵醪中最高乙醇含量依次為9.4％、10.0％和10.2％，其中SS15和SS17菌株的成熟發(fā)酵醪中最高乙醇含量與出發(fā)株SS04的相比，分別提高了6.4％和8.5％；SS04、SS15和SS17三個(gè)菌株的糖轉(zhuǎn)化率分別為86.87％、87.64％和88.74％。這些可能與NADH流向和谷氨酸脫氫酶的表達(dá)量有關(guān)。 3.在快速提取酵母基因組DNA過程中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用渦旋振蕩法提取基因組DNA，在不加玻璃珠而延長渦旋振動(dòng)時(shí)間