釀酒酵母Sfilp相關(guān)多肽的結(jié)構(gòu)和功能分析.pdf

1、紡錘體極體是酵母的微管組織中心，半橋是有絲分裂中新的紡錘體極體的形成點，Sfilp定位在半橋上，缺失Sfilp，細(xì)胞有絲分裂停滯在G2/M期，減數(shù)分裂產(chǎn)生非正常孢子。Sfilp通過其內(nèi)部重復(fù)序列與中心體蛋白Cde31p結(jié)合，重復(fù)序列之間以間隔序列隔開，間隔序列的存在為相鄰中心體蛋白提供分子間相互作用的空間。Sfilp/Cdc31p復(fù)合物的空間構(gòu)象與Ca2+的濃度密切相關(guān)。Sfilp的第765位至775位氨基酸處在中部重復(fù)序列的最后一個間

2、隔序列(gap)上，是影響蛋白質(zhì)折疊的關(guān)鍵部位。有研究表明突變?yōu)楦彼釙功?螺旋的折疊停止。所以，在該實驗中研究第774位氨基酸突變后對Sfilp結(jié)構(gòu)和功能的影響，為研究Sfilp結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系以及Ca2+對Sfilp空間構(gòu)象的調(diào)控機理提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 在該實驗中，化學(xué)合成野生型多肽SP774-T和突變多肽SP774-P，突變多肽由野生型多肽的蘇氨酸突變?yōu)楦彼岬玫?。一方面，研究突變對Sfilp結(jié)構(gòu)的影響，

3、包括：通過高效液相色譜(HPLC)檢測多肽的純度，通過蛋白質(zhì)在線工具軟件、輔助基質(zhì)電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析多肽的一級結(jié)構(gòu)，通過紫外吸收光譜(UV)、圓二色光譜(CD)研究pH值、金屬離子對多肽二級結(jié)構(gòu)的影響，通過計算機同源建模(Homology Modeling)、MOE分子模擬研究多肽的三級結(jié)構(gòu)；另一方面，研究突變對Sfilp功能的影響，包括：通過定點誘變PCR技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)突變蛋白的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌

4、株構(gòu)建突變酵母菌株，此菌株利用突變蛋白進(jìn)行生長，觀察突變菌株的生長情況。
　　 實驗結(jié)果表明在Ca2+濃度為零的條件下，野生型多肽與突變多肽的空間構(gòu)象非常相似，α螺旋含量分別為67.45％和61.33％。當(dāng)1摩爾當(dāng)量的Ca2+加入體系后，野生型多肽SP774-T的α螺旋含量提高至84.27％，但是突變多肽SP-P的α螺旋含量基本維持不變(64.27％)。說明Sfilp的第774位氨基酸突變后，影響了Sfilp的空間構(gòu)象，也從實驗

5、的角度印證了Salisbury的“彈性繩”模型。野生型多肽SP774-T的紫外吸收與Cu含量、pn值正相關(guān)。pH9時，Cu比例為1、2時，紫外吸收劇增。計算機同源建模和MOE分子模擬得出的空間構(gòu)象圖表明突變后多肽構(gòu)象末端稍有改變。在23℃下，SP774-P長勢良好，在37℃下，生長受到抑制。說明突變后Sfilp的空間結(jié)構(gòu)改變，影響到Sfilp的功能，使酵母不能正常生長。
　　 此外，亦做了以下研究：構(gòu)建可用于腫瘤基因治療的雙基因

6、沉默載體，通過一個shRNA轉(zhuǎn)錄單元同時獲得兩個獨立的shRNA轉(zhuǎn)錄子，并且由PolⅡ啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，由核酶剪切，由MAZ終止。結(jié)果顯示靶向腫瘤相關(guān)基因的雙基因沉默載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對腫瘤相關(guān)靶基因有不同程度的沉默。這種載體構(gòu)建方法的優(yōu)點在于單一的轉(zhuǎn)錄單元可避免多轉(zhuǎn)錄單元之間的啟動子干擾效應(yīng)，且具有組織特異性，此外，核酶切除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端帽子結(jié)構(gòu)，MAZ終止位點使3’端無polyA尾巴，減緩了dsRNA由細(xì)胞核到胞漿的運輸速度，使