粟酒裂殖酵母snR88和U18snoRNA的功能分析.pdf

1、核仁小分子RNA(smaU nucleoar RNA，snoRNA)是一類代謝穩(wěn)定、特征鮮明、具有重要功能的非編碼RNA(non-coding RNA)。根據(jù)其保守的序列元件和二級結(jié)構(gòu)，snoRNA分為boxC/D和boxH/ACA兩大家族。這兩種類型的snoRNA，除少數(shù)參與pre-rRNA的剪切加工外，大多數(shù)負責(zé)指導(dǎo)rRNA或snRNA在進化上高度保守區(qū)域的2’-O-核糖甲基化和假尿嘧啶化修飾。通過不同的實驗RNA組學(xué)和計算機RNA

2、組學(xué)方法，已在多種模式生物中如酵母、水稻、果蠅、人以及古細菌等進行了大規(guī)模的snoRNA鑒定與分析。隨著研究的不斷深入，snoRNA日益呈現(xiàn)出許多結(jié)構(gòu)與功能的新特點。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)是研究真核生物分子生物學(xué)良好的模式生物之一，其主要優(yōu)勢在于能夠進行簡便、高效的基因敲除，這對于深入研究snoRNA的功能提供了極大的便利。本文通過敲除粟酒裂殖酵母的snR88和U18兩個bOX C/D snoR

3、NA，主要獲得了如下研究結(jié)果： 通過篩選本實驗室先前建立的粟酒裂殖酵母小分子RNA的cDNA文庫，一個長84nt的新的box C/D snoRNA被鑒定出來，命名為snR88。snR88的保守元件box C有較大變異，這可能是計算機分析難以將其搜索到的主要原因。snR88有兩條反義序列，是粟酒裂殖酵母中為數(shù)不多的雙引導(dǎo)(double guide)snoRNA之一，預(yù)測其指導(dǎo)粟酒裂殖酵母25S-rRNA U2304和U2497兩個

4、位點的2’-O-核糖甲基化修飾。snR88基因位于粟酒裂殖酵母Ⅰ號染色體上的基因間隔區(qū)，生物信息學(xué)分析顯示其不是由內(nèi)含子編碼，也不屬于基因簇。利用同源重組技術(shù)，snR88基因編碼區(qū)上游的啟動子元件TATA box被敲除，這導(dǎo)致snR88的表達被完全抑制，證明它是一個獨立編碼基因。在用低濃度dNTP法檢測snR88所指導(dǎo)修飾的甲基化位點時發(fā)現(xiàn)，Um2497能夠產(chǎn)生三條逆轉(zhuǎn)錄停頓帶；我們用堿水解法進一步證實這三條逆轉(zhuǎn)錄帶實際來自于Um249

5、7一個位點的甲基化，并推測此處的甲基化修飾對核糖體RNA的高級結(jié)構(gòu)有重要影響。釀酒酵母中的U24，U18，snR13和snR52四個box C/D snoRNA具有異常修飾功能，即除了能指導(dǎo)靶分子第五位核苷酸的甲基化修飾外，還能指導(dǎo)相鄰的第六位核苷酸的甲基化修飾。在粟酒裂殖酵母中成功地將U18敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為釀酒酵母U18的同源分子，粟酒裂殖酵母的U18 snoRNA并不具備異常修飾功能，僅指導(dǎo)25S-rRNA A674一個核苷酸的甲

6、基化修飾。我們分析了九個物種U18 snoRNA的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)U18在各個物種中高度保守，保守元件和功能序列變異極小。進一步分析釀酒酵母和粟酒裂殖酵母U18同源分子的特點，發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母的U18靠近boxD’的核苷酸不能像釀酒酵母的U18一樣形成“bulge”結(jié)構(gòu)，這可以作為“bulge”假說的一個佐證。通過比較分析U18的同源分子在不同物種中的作用，對于深入揭示box C/D snoRNA功能發(fā)揮過程的機理具有重要意義。

7、采用細胞密度梯度稀釋法，我們調(diào)查了snoRNA基因的缺失對酵母生長的影響。在37℃、抗生素G418存在時，U18的特異缺失株能夠生長，U18的非特異缺失株則死亡；U18和Z16的非特異缺失株，在37℃、抗生素G418存在時均能生長，U18和snR88的特異缺失株則不能生長；U18和snR88的特異缺失株在30℃、抗生素G418存在時，都能生長，但是snR88缺失株的生長速度明顯比U18缺失株的生長速度慢。這些現(xiàn)象說明，不同snoRNA基

8、因的缺失，對酵母生長的影響程度不同；在環(huán)境溫度較高(37℃)、有抗生素(G418)存在時，核糖體RNA的2’-O-甲基化對維持酵母的生長有重要作用。通過分析多個物種box C/D snoRNA的功能序列發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)box C/DsnoRNA的反義序列與其臨近的box D/D’相隔一個堿基，而且這個相隔堿基的組成有強烈的偏好性，以A和U為主，約占70～80﹪，植物中則高達90﹪。結(jié)合已有的研究成果，我們認為這種堿基組成偏好性可能是生物為了