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1、線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝,糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場(chǎng)所,為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量,是細(xì)胞氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所,有細(xì)胞“動(dòng)力工廠”之稱。另外,線粒體有自身的DNA和遺傳體系,但基因組的基因數(shù)量有限,因此,線粒體只是一種半自主性的細(xì)胞器。線粒體的表達(dá)障礙直接導(dǎo)致各種各樣的疾病,如何治療線粒體疾病成為目前的研究重點(diǎn)。許多研究表明,線粒體功能異常與帕金森氏癥、阿爾茲海默病、糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān),既是疾病
2、病因之一,又是疾病發(fā)病的早期征兆。因此研究線粒體基因表達(dá)機(jī)制,可以為治療線粒體基礎(chǔ)疾病提供幫助。Mpa1是我們實(shí)驗(yàn)室通過串聯(lián)親和純化(Tandem affinity purification)、免疫共沉淀和質(zhì)譜(mass spectrometry)鑒定技術(shù),發(fā)現(xiàn)的與Ppr10有體內(nèi)相互作用的蛋白。mpa1是未被研究過的一個(gè)新穎的基因,因而本研究選擇mpa1基因作為研究對(duì)象。
本研究借助在線工具M(jìn)itoProtⅡ(https:/
3、/ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析結(jié)果得知,Ppr10含有線粒體的定位信號(hào)肽,但是無法預(yù)測(cè)到Mpa1的線粒體定位信號(hào)肽。由于Mpa1與Ppr10蛋白存在體內(nèi)相互作用,猜測(cè)Mpa1與Ppr10共定位。為了進(jìn)一步明確Mpa1的定位,對(duì)Mpa1做了亞細(xì)胞定位,最終確定Mpa1定位于線粒體基質(zhì)。為了研究Mpa1的相關(guān)功能,首先以單倍體酵母菌株yHL6381為出發(fā)菌株構(gòu)建了mpa1基因缺失突變株。接下來,針對(duì)突變株進(jìn)
4、行了一系列的表型研究:包括生長(zhǎng)曲線測(cè)定,細(xì)胞形態(tài)觀察,不同生長(zhǎng)階段的存活能力、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和非發(fā)酵性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況及對(duì)線粒體呼吸鏈抑制劑抗霉素A的敏感性研究。表型研究結(jié)果表明,mpa1基因缺失突變株在與呼吸功能相關(guān)的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷,并且在生長(zhǎng)階段后期生存能力嚴(yán)重受損??偟膩碚f△mpa1是線粒體呼吸缺陷菌株。同時(shí),Western Blot技術(shù)進(jìn)一步分析得出,mpa1的缺失導(dǎo)致線粒體相關(guān)蛋白的合成量降低。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了△mpa
5、1/pJK148-1500-mpa1-3HA菌株,且可以正常表達(dá)Mpa1蛋白。點(diǎn)圈實(shí)驗(yàn)證明菌株可以彌補(bǔ)mpa1基因缺失突變株在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)缺陷,同時(shí)Western Blot證明回補(bǔ)菌株可以恢復(fù)線粒體蛋白的合成。由此可知,mpa1的自身調(diào)控序列在5'-UTR上游1500 bp范圍內(nèi),并驗(yàn)證了mpa1是非必需基因。在此基礎(chǔ)上,對(duì)缺失特定區(qū)域的Mpa1結(jié)構(gòu)的研究。無論缺失哪部分區(qū)域,都可以正常表達(dá)Mpa1,但都不能彌補(bǔ)可以彌補(bǔ)mpa1
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