釀酒酵母Ⅲ號染色體不同活性的ARS體外形成核小體能力的比較.pdf

1、復(fù)制起始位點的精細(xì)調(diào)控是基因組信息的準(zhǔn)確傳遞和細(xì)胞周期協(xié)調(diào)運行的保證,DNA復(fù)制的起始是蛋白復(fù)制因子與復(fù)制子協(xié)同作用的結(jié)果,真核生物是如何選擇其復(fù)制子及核小體定位是如何調(diào)控真核生物的復(fù)制起始,目前還不是很清楚。本文的工作包括YKN-10酵母細(xì)胞的同步化、復(fù)制起始序列301和305的活性驗證及釀酒酵母Ⅲ號染色體不同復(fù)制起始活性序列形成核小體能力的比較,具體內(nèi)容如下:
　　1.利用α因子停滯細(xì)胞生長法研究釀酒酵母細(xì)胞YKN-10的同步

2、化,在0~5 h的細(xì)胞培養(yǎng)中分別加入濃度梯度為25~200μg mL-1的α因子,每隔0.5h在熒光倒置顯微鏡下觀察釀酒酵母細(xì)胞的出芽形態(tài),記錄細(xì)胞的出芽率,然后用SPSS17.0對酵母細(xì)胞的出芽率進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,α因子的濃度、α因子作用時間及二者的交互效應(yīng)均對酵母細(xì)胞的平均出芽率有顯著影響;α因子濃度在175~200μg mL-1下培養(yǎng)酵母細(xì)胞約3.5~4h時,酵母細(xì)胞基本上達到了同步化狀態(tài)。運用α因子停滯細(xì)胞生長法獲得了同步

3、化的YKN-10酵母菌群體,為非Δbar1突變菌株的同步化研究提供了參考。
　　2.通過BrdU標(biāo)記新合成 DNA的方法,驗證釀酒酵母菌復(fù)制起始序列301和305的復(fù)制起始活性。對新合成DNA分別用BrdU標(biāo)記5min、10min、15min和20min,提取酵母基因組,通過小鼠抗BrdU單克隆抗體和FITC-羊抗小鼠IgG抗體進行抗體免疫沉淀及純化來富集新合成的DNA鏈,利用PCR技術(shù)驗證DNA復(fù)制起始序列的活性。結(jié)果表明復(fù)制起

4、始序列301不具有復(fù)制起始活性或具有較低復(fù)制起始活性,復(fù)制起始序列305具有一定的復(fù)制起始活性;標(biāo)記5min和10min時,新合成DNA的長度為300bp和450bp左右。復(fù)制起始序列的活性鑒定為探究復(fù)制起始位點的選擇機理奠定了基礎(chǔ)。
　　3.將釀酒酵母Ⅲ號染色體上的10個復(fù)制起始序列分為高活性和低活性兩組復(fù)制起始序列,利用核小體體外組裝技術(shù),將回收純化的高活性和低活性復(fù)制起始序列分別與組蛋白八聚體在體外進行梯度鹽透析組裝形成核小