釀酒酵母核小體定位理論模型的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、核小體作為真核生物中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)成單位,在基因組上的動(dòng)態(tài)定位能夠影響真核生物的基因表達(dá)調(diào)控。研究表明,DNA序列因素是影響核小體定位的主要因素,體內(nèi)也受到染色質(zhì)重塑、DNA甲基化、組蛋白變體與組蛋白修飾、RNA可變剪接等表觀因素的影響。
　　基于特定的理論模型來(lái)預(yù)測(cè)模式生物核小體定位,是研究真核生物基因組中核小體定位特征與其調(diào)控基因表達(dá)作用的重要手段。核小體在真核生物基因組中的非均勻分布與動(dòng)態(tài)定位,與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。

2、本文根據(jù)我們課題組前期構(gòu)建的基于位置權(quán)重矩陣計(jì)算核小體定位的理論模型,以1bp為步長(zhǎng),147bp為窗口,分別選取了釀酒酵母1、3、14號(hào)染色體上定位較為典型的核小體定位能力強(qiáng)、中、弱各3條147bp序列,采用體外實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證該理論模型在預(yù)測(cè)酵母基因組核小體定位的有效性。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.克隆了9條目的DNA序列。利用珠磨法提取酵母基因組作為模板,根據(jù)計(jì)算的DNA序列在基因組上的位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,將目的序列擴(kuò)增,雙

3、酶切后插入到載體的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒。利用標(biāo)記biotin和Cy3熒光分子的引物,大量擴(kuò)增并回收了9條目的序列,用于核小體組裝實(shí)驗(yàn)。
　　2.表達(dá)純化了組蛋白H2A、H2B、H3和H4,復(fù)性并裝配形成組蛋白八聚體。表達(dá)純化后的組蛋白經(jīng)電泳檢測(cè),蛋白條帶位置正確,純度高。用牛血清清蛋白繪制了蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)為0.9824,測(cè)定了組蛋白的濃度,用于核小體組裝實(shí)驗(yàn)。
　　3.Biotin標(biāo)記檢測(cè)了目的序列對(duì)組蛋白八聚體

4、的親和性。用鹽透析法體外組裝核小體結(jié)構(gòu),經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記檢測(cè)及量化,計(jì)算每條序列形成核小體的吉布斯自由能,分析它們與組蛋白八聚體的親和力。結(jié)果表明,9條序列中有5條序列與理論預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致,有4條不完全一致,但總體規(guī)律符合理論預(yù)測(cè)結(jié)果;對(duì)釀酒酵母1、3、14號(hào)染色體上各3條理論設(shè)計(jì)形成核小體能力強(qiáng)、中、弱序列分別求得反應(yīng)過(guò)程中的表觀平衡常數(shù)Keq的平均值。結(jié)果表明,9條序列實(shí)驗(yàn)結(jié)果所呈現(xiàn)出來(lái)的規(guī)律性,與理論預(yù)測(cè)結(jié)果基本保持一致。