重復(fù)序列GAA及R5Y5的核小體定位理論與實驗研究.pdf

1、真核生物基因組以高度壓縮的染色體形式存在，核小體是構(gòu)成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，基因組上核小體的相對位置稱為核小體定位。核小體定位對包括DNA復(fù)制、修復(fù)、重組及可變剪接等在內(nèi)的眾多生物學(xué)過程起著調(diào)控作用。比如，核小體的形成影響反式作用因子與核小體DNA的結(jié)合，為調(diào)控蛋白的結(jié)合提供了可選擇性;構(gòu)成核小體的組蛋白尾部發(fā)生化學(xué)修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響其與調(diào)控因子的結(jié)合。所以，核小體作為一種真核生物染色體基本結(jié)構(gòu)單元，履行著結(jié)構(gòu)與功能的雙重

2、作用。核小體定位受到DNA序列內(nèi)在特性及諸如組蛋白變體、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶競爭等外在因素的影響，其中DNA序列特性是影響核小體定位最為重要的因素之一。
　　基因組中特定位點三核苷酸重復(fù)序列（如GAA、CAG等）與40余種人類神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳疾病相關(guān)，這類疾病的致病機理可能與重復(fù)序列局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Friedreich共濟(jì)失調(diào)(FRDA)患者體內(nèi)FXN基因第一內(nèi)含子中GAA重復(fù)序列周圍表觀遺傳修飾異常，而體

3、外實驗證實GAA22重復(fù)序列形成核小體能力較弱。在正常人體內(nèi)，GAA重復(fù)序列的核小體定位特征及其對染色質(zhì)局部結(jié)構(gòu)的影響仍然是一個懸而未決的問題，該問題對于在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上理解FRDA疾病的致病機理具有重要的理論意義。
　　近30余年，人們利用各種方法尋找可能隱含在核小體DNA中的序列模體。以色列科學(xué)家Trofonov教授通過分析線蟲、果蠅、人和酵母等模式生物的核小體定位數(shù)據(jù)，分別建立了N-gram延伸模型、彎曲矩陣模型和堆積能模

4、型。三個模型從不同的角度對核小體占據(jù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后提出了核小體定位的RRRRRYYYYY(R5Y5)序列模體，其中R是嘌呤，Y是嘧啶。R5Y5序列模體提出后，在國際上引起很大爭議，到目前為止，依然缺乏有效的實驗證明R5Y5序列模體對核小體定位的影響。
　　論文結(jié)合理論統(tǒng)計分析和體外實驗方法，研究了含GAA重復(fù)序列和R5Y5模體序列核小體定位的規(guī)律，期望理解DNA序列對核小體定位影響的機制。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)首先

5、，統(tǒng)計了人基因組中18種三核苷酸重復(fù)序列核小體定位特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)富含AA或TT的三核苷酸重復(fù)序列形成核小體的能力非常弱。其次，重點關(guān)注與疾病相關(guān)的GAA重復(fù)序列的核小體定位特征，發(fā)現(xiàn)基因組中緊鄰GAA重復(fù)序列上游分布著大量的A-tracts，這些A-tracts的存在會影響局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，GAA重復(fù)片段本身可以導(dǎo)致局部的核小體缺乏，而上游A-tracts會進(jìn)一步加劇這種缺乏程度。體內(nèi)含有GAA重復(fù)序列特定位點的核小體定位圖譜同樣證實GA

6、A重復(fù)序列是一個弱的核小體定位元件。
　　(2)從大腸桿菌中表達(dá)純化了6種重組組蛋白(H2A、H2B、H3、H4、H2A.Z和H3.3)，裝配了常規(guī)組蛋白八聚體、含變體H2A.Z及H3.3的組蛋白八聚體，這三種組蛋白八聚體可用于體外組裝核小體及染色質(zhì)實驗。
　　(3)通過體外重組染色質(zhì)實驗，發(fā)現(xiàn)了GAA重復(fù)序列可導(dǎo)致局部核小體占據(jù)率下降。構(gòu)建了含有GAA7、GAA27、GAA42片段的3種重組質(zhì)粒及含有CAG7、CAG27、

7、CAG44和601序列共4種實驗對照質(zhì)粒。在質(zhì)粒上組裝了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過微球菌核酸酶酶切實驗、電鏡和蔗糖梯度密度離心等方法發(fā)現(xiàn):相比于601序列，GAA42重復(fù)序列插入到質(zhì)粒中不利于質(zhì)粒形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過分析超速離心定量檢測發(fā)現(xiàn)，含有GAA重復(fù)序列的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)比含有CAG重復(fù)序列或601序列的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛、核小體占據(jù)水平偏低，說明GAA重復(fù)序列插入到質(zhì)粒中可能降低了重組質(zhì)粒體外形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力。
　　(4)通過體外重

8、組核小體的實驗，發(fā)現(xiàn)R5Y5是一種有利于常規(guī)核小體形成的序列模體?；赗5Y5模體及TA10.5-bp周期性規(guī)律，設(shè)計了CS1-CS6共6條序列，利用體外組裝核小體的實驗技術(shù)，研究了這些序列形成核小體的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在常規(guī)核小體形成過程中，DNA序列中R5Y5和TA10.5-bp周期特性都極其顯著地促進(jìn)核小體的形成，相比較而言，TA10.5 bp周期性的影響更為顯著。在含有H2A.Z變體的核小體體外組裝過程中，TA10.5-bp周期性