川桑著絲粒與端粒重復(fù)序列及染色體定位.pdf

1、重復(fù)序列是構(gòu)成高等植物基因組的重要組成部分，不僅在維持染色體的空間結(jié)構(gòu)、基因的表達調(diào)控、遺傳重組等方面都具有重要作用，而且串聯(lián)重復(fù)的DNA簇往往具有種屬甚至染色體的特異性。因此，克隆和分析重復(fù)序列是研究高等植物基因組的有效手段。川桑（Morus notabilis）基因組大小約為330Mb，含有128Mb的重復(fù)序列。本文首次對川桑著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列（Centromeric tandem repeat sequence，CTR）和端粒相關(guān)

2、序列（Telomere associated sequence，TAS）進行了研究，并采用熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）將它們應(yīng)用于川桑的核型分析中，獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1．采用生物信息學(xué)方法，對川?；蚪M重復(fù)序列進行了由高到低的復(fù)雜度排序，篩選出拷貝數(shù)最多、排布區(qū)域最大的4條DNA序列的重復(fù)單元作為川桑候選著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列，分別命名為CCTR964、

3、CCTR723、CCTR327、CCTR251。這4條序列與其他物種的著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列的相似性較低，介于1％至28%之間，具有較高的物種特異性。隨后將其制備為探針，分別與川桑中期染色體進行熒光原位雜交，研究發(fā)現(xiàn)：
　　①CCTR964在川桑1號、2號、4號、6號染色體的著絲粒及3號染色體的近著絲粒短臂上有雜交信號；
　?、贑CTR723定位于川桑2號染色體近著絲粒短臂和5號染色體的著絲粒上；
　?、跜CTR327在川

4、桑3號、4號、5號染色體的著絲粒處有所分布，其中在3號、4號染色體的著絲粒處信號較弱，在5號染色體的著絲粒處信號強烈，此外，還在1號、2號染色體兩臂的近著絲粒處成散在分布；
　　④CCTR251在除6號染色體以外的其他染色體的著絲粒處都有分布，其中，在2號、3號染色體的著絲粒處的分布最為明顯。因此，初步斷定這4條序列均為川桑著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列。
　　2．分別以擬南芥端粒簡單重復(fù)序列（Telomere repeat seque

5、nce，TR）(TTTAGGG)4、(CCCTAAA)3為單引物，在川?；蚪M中進行擴增，在前者擴增產(chǎn)物中獲得1條長度為540bp的DNA序列，在后者擴增產(chǎn)物中獲得1條403bp的DNA序列和1條420bp的DNA序列。將其依次命名為TAS1、TAS2、TAS3。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，這3條序列均富含AT，符合衛(wèi)星序列的特點。此外，這些序列中除含有不同數(shù)目的擬南芥型端粒簡單重復(fù)序列單元的突變體外，還存在著其他類型的重復(fù)單元，如家蠶TR單元CC

6、TAA、番茄TR單元TTTGGG。同源性分析發(fā)現(xiàn)，TAS1、TAS2、TAS3與其他物種的端粒相關(guān)序列相似性均很低，同樣呈現(xiàn)較高的物種特異性。
　　熒光原位雜交研究結(jié)果顯示：
　　①TAS1在川桑2號染色體短臂末端，4號、5號染色體兩端，6號染色體一端有明顯分布，在其他染色體上幾乎沒有信號；
　　②TAS2在川桑1號、6號染色體兩端，2號染色體短臂、3號長臂、4號和5號染色體的一端有所分布，只在7號染色體上沒有檢測到信

7、號；
　?、墼谳^高洗脫嚴謹度的條件下，TAS3在川桑7對同源染色體上均有所分布，但未涵蓋所有染色體的末端，并且信號的強度均較弱。當提高洗脫強度時，無法檢測到TAS3序列的定位信號，因此，推測TAS3在川桑染色體上具有較低的拷貝數(shù)。
　　3．結(jié)合CCTR964、CCTR723、CCTR251及TAS1、TAS2探針在各條染色體上的雜交信號，建立了川桑標準染色體的核型模式圖，給川桑的核型分析提供了新的依據(jù)，為川桑染色體的精確識別