NS與PPP2R5A在HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)共定位及Pcmv Myc-PPP2R5A表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、目的:
　　 核干細(xì)胞因子(Nucleostemin,NS)是2002年發(fā)現(xiàn)的維持干細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖狀態(tài)而不分化所必須的蛋白質(zhì),表達(dá)于干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的核或核仁中,能與p53結(jié)合,人為控制或抑制NS的表達(dá)能改變癌細(xì)胞的病理性質(zhì)[1]。本課題先前的研究發(fā)現(xiàn)NS在白血病細(xì)胞系HL-60、K562及不同類型的急性白血病中均存在高表達(dá)現(xiàn)象[2],NS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式普遍認(rèn)為與p53有關(guān),但這一理論無法解釋p53缺失型白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞的一

2、些生物學(xué)現(xiàn)象。人蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase2A,PP2A)是一種絲／蘇氨酸磷蛋白磷酸酶,通過可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白質(zhì)脫磷酸,在信號(hào)傳導(dǎo)承擔(dān)負(fù)性調(diào)節(jié)的作用,在細(xì)胞的凋亡、增生、分化、代謝中起重要作用。PPP2R5A是PP2A的調(diào)節(jié)亞單位B的α異構(gòu)體(alpha isoform of protein phosphatase2 regulatory subunit B),決定了PP2A與底物的特異性,介導(dǎo)

3、PP2A在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[3],有資料顯示NS與PPP2R5A兩蛋白之間存在相互作用[4],但PPP2R5A在急性白血病細(xì)胞中是否表達(dá),及其與NS是否有相互作用,目前國內(nèi)外還未見報(bào)道。該課題總的目標(biāo)是探討是否存在非p53依賴的NS信號(hào)傳導(dǎo)途徑?非p53依賴的NS信號(hào)傳導(dǎo)途徑是否與PPP2R5A蛋白和PP2A介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)?本課題是其子課題,旨在驗(yàn)證在p53缺失型細(xì)胞內(nèi)是否有NS與PPP2R5A的表達(dá)和共定位,以及構(gòu)建pCMV My

4、c-PPP2R5A表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞,擴(kuò)大PPP2R5A表達(dá),為驗(yàn)證NS與PPP2R5A存在相互作用的co-IP奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)RT-PCR、免疫組化和方法檢測PPP2R5A在HL-60白血病細(xì)胞系以及急性白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 (2)PT-PCR方法檢測NS基因和p53基因在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 (3)雙重免疫熒光染色法和激光光共聚焦技術(shù)

5、觀察NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細(xì)胞中的共定位情況。
　　 (4)構(gòu)建pCMV Myc-PPP2R5A重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化DH5α,提取質(zhì)粒,應(yīng)用PCR技術(shù)和測序方法鑒定重組克隆。
　　 (5)將pCMV Myc-PPP2R5A重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞,使PPP2R5A蛋白在HL-60細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)。
　　 (6)數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,對定量資料,統(tǒng)計(jì)學(xué)均數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)

6、±SD)表示；對定性資料采用x2檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用方差分析,方差不齊時(shí)進(jìn)行變量變換。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 (1)PPP2R5A在白血病細(xì)胞中的表達(dá):RT-PCR、免疫組化和Western blot結(jié)果顯示PPP2R5A在白血病細(xì)胞系HL-60和急性白血病患者(M5、M2、M3、ALL、混合性白血病)的外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈表達(dá)狀態(tài),且在各類急性白血病中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

7、)。
　　 (2)p53基因在HL-60細(xì)胞中的表達(dá):PT-PCR結(jié)果顯示p53基因在HL-60細(xì)胞中不表達(dá)。
　　 (3)NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細(xì)胞中的共定位情況:激光共聚焦結(jié)果顯示NS和PPP2R5A兩種蛋白在HL-60細(xì)胞胞漿和胞核中均有表達(dá),其中NS蛋白以核仁表達(dá)為主,PPP2R5A蛋白以胞漿表達(dá)為主,二者存在共定位現(xiàn)象。
　　 (4)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)果:成功構(gòu)建pCMV myc—PPP