P53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對(duì)mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響.pdf

1、目的：
　　結(jié)合本課題組前期關(guān)于 p53缺失型 HL-60白血病細(xì)胞內(nèi) PI3K/AKT/mTOR通路的研究結(jié)果，進(jìn)一步探討下調(diào)Nucleostemin（NS）對(duì)p53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響，為研究PI3K/AKT/mTOR通路作為NS非p53依賴(lài)性信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）制備重組質(zhì)粒（編碼慢病毒顆粒）和兩種輔助包裝原件的載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收

2、集富含病毒顆粒的上清液，濃縮后用293T細(xì)胞測(cè)定其病毒滴度。
　?。?）分別以低MOI值（MOI=40）和高M(jìn)OI值（MOI=80）的慢病毒轉(zhuǎn)染液感染HL-60細(xì)胞確定慢病毒感染HL-60細(xì)胞的合適MOI值。
　　（3）根據(jù)合適的MOI值，將NS-RNAi-GV248慢病毒載體轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞，通過(guò)熒光倒置顯微鏡和Western blot確定轉(zhuǎn)染的效率和NS蛋白的下調(diào)情況。
　　（4）采用吖啶橙染色觀察慢病毒載體轉(zhuǎn)

3、染后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞內(nèi)亮紅色酸性小體（acid vesicular organelle，AVO）數(shù)量的變化。
　?。?）以自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素刺激HL-60細(xì)胞所提取的蛋白作為自噬陽(yáng)性對(duì)照蛋白，檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)自噬特異性蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的變化。
　　（6）采用透射電鏡檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞內(nèi)自噬性結(jié)構(gòu)數(shù)量的變化。

4、>　?。?）采用Image J圖像處理軟件對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行分析和計(jì)算。運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示。多組樣本間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩的比較采用Bonferroni法，校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α，=0.0167。
　　結(jié)果：
　　（1）成功包裝NS-RNAi-GV248慢病毒載體，其滴度為4×108TU/ml。
　?。?）NS-RNAi-GV248慢病毒載體感染

5、HL-60細(xì)胞的最適MOI值為80。在MOI=80的感染條件下，熒光倒置顯微鏡檢測(cè)顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率大于80％，實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞NS蛋白出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。
　?。?）吖啶橙染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞內(nèi)AVO數(shù)量[（22.4±0.76）%]高于空白對(duì)照組[（3.1±0.28）%]和陰性對(duì)照組[（6.2±0.64）]%（p＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（1

6、.537±0.072）高于陰性對(duì)照組（1.010±0.039）和空白對(duì)照組（0.608±0.008）（p＜0.05）；透射電鏡檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組中 HL-60細(xì)胞內(nèi)自噬性結(jié)構(gòu)的數(shù)量（8.7±3.1）高于陰性對(duì)照組（4.2±1.2）和空白對(duì)照組（2.3±0.5）（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）下調(diào)NS蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)HL-60細(xì)胞的自噬活性。
　　（2）NS變化引起的自噬活性的改變，提示mTOR通路可能屬于NS的