二烯丙基二硫?qū)Ω弑磉_(dá)cofilin1白血病HL-60細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：研究二烯丙基二硫(DADS)對人白血病HL-60細(xì)胞中cofilin1表達(dá)以及其增殖、遷移、侵襲與分化的影響，并探討其作用的分子機(jī)制。
　　方法：RT-PCR和Western blot檢測DADS對HL-60細(xì)胞中的cofilin1及p-cofilin1表達(dá)的影響以及信號通路Rac1-ROCK1-LIMK1中各因子表達(dá)的改變。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將高表達(dá)cofilin1基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EG

2、FP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，構(gòu)建高表達(dá)cofilin1的HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP細(xì)胞系。RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞cofilin1表達(dá)的變化，并觀察DADS對高表達(dá) cofilin1的HL-60細(xì)胞中cofilin1表達(dá)的影響；NBT細(xì)胞還原實(shí)驗(yàn)、CCK-8增殖檢測實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞免疫熒光觀察DADS對HL-60細(xì)胞及高表達(dá) cofilin

3、1的HL-60細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；RT-PCR和Western blot檢測DADS對高表達(dá)cofilin1的HL-60細(xì)胞Rac1-ROCK1-LIMK1信號通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1. DADS對HL-60細(xì)胞的cofilin1表達(dá)的影響
　　RT-PCR和Western blot顯示，DADS作用HL-60細(xì)胞0h、6h、12h、24h、48h后，cofilin1和p-cofilin1在mRNA表達(dá)水平和

4、蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為時間依賴性的下降(P<0.05)。
　　2. DADS對HL-60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及還原能力的影響
　　NBT還原實(shí)驗(yàn)顯示，DADS處理24h、48h、72h后，細(xì)胞對硝基藍(lán)四唑的還原能力表現(xiàn)為時間依賴性的增強(qiáng)(P<0.05)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，DADS可呈時間依賴性的抑制HL-60細(xì)胞的增殖(P<0.05)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，DADS處理后，HL-60細(xì)胞的遷移、侵襲能力可呈時間

5、依賴性下降(P<0.05)。DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　3. DADS對高表達(dá)cofilin1的HL-60細(xì)胞中cofilin1表達(dá)的影響
　　構(gòu)建高表達(dá)cofilin1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，RT-PCR和Western blot顯示，轉(zhuǎn)染cofilin1的高表達(dá)載體的后， HL-60細(xì)胞中cofilin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

6、與未轉(zhuǎn)染組及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較明顯上升，表明HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　RT-PCR與Western blot顯示，DADS處理前后，未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組及高表達(dá)組細(xì)胞的cofilin1和p-cofilin1在mRNA和蛋白表達(dá)水平具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　4. DADS對高表達(dá)cofilin1的HL-60細(xì)胞的分化的影響
　　NBT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS分

7、別處理未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和高表達(dá)組細(xì)胞24h后，HL-60細(xì)胞對硝基藍(lán)四唑的還原能力較未處理組細(xì)胞明顯增強(qiáng)(P<0.05)；高表達(dá)組細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染組及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的還原能力明顯降低(P<0.05)，DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS處理后，未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組及高表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力較未處理的各組均減弱，且未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較高表達(dá)組細(xì)胞的增殖抑制更明顯(P<0.05

8、)。DADS處理組與ATRA處理組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明高表達(dá)cofilin1可以減弱DADS對HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS分別處理未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組及高表達(dá)組細(xì)胞后，其細(xì)胞穿過膜和基質(zhì)膠的數(shù)量較未處理的各組細(xì)胞均減小(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組較高表達(dá)組穿過膜和基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)減少更明顯(P<0.05)。DADS組與ATRA組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.0

9、5)。表明高表達(dá)cofilin1可以減弱DADS對HL-60細(xì)胞的遷移、侵襲抑制作用。
　　細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，DADS處理后，未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組及高表達(dá)組細(xì)胞的CD11b蛋白表達(dá)水平較未處理的各組明顯上升，CD33蛋白表達(dá)水平較未處理的各組明顯下調(diào)。
　　5. DADS對HL-60細(xì)胞中的Rac1-ROCK1-LIMK1信號通路的影響
　　RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，DADS作用HL-60細(xì)胞

10、0h、6h、12h、24h、48h后，Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為時間依賴性的下降(P<0.05)。
　　6. DADS對高表達(dá)cofilin1的HL-60細(xì)胞的Rac1-ROCK1-LIMK1通路的影響
　　RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，DADS處理后，未轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和高表達(dá)組細(xì)胞的Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表達(dá)

11、水平較未處理的各組均顯著下降(P<0.05)。DADS處理后的高表達(dá)組細(xì)胞較DADS處理后的未轉(zhuǎn)染組和陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的Rac1、ROCK1、LIMK1、p-LIMK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1. DADS可下調(diào)cofilin1活性，抑制HL-60細(xì)胞增殖、遷移與侵襲及誘導(dǎo)分化。
　　2．DADS拮抗Rac1-ROCK1-LIMK1通路下調(diào)cofilin1表達(dá)與磷酸化，抑制