DADS對(duì)DJ-1核定位高表達(dá)人白血病HL-60細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:研究二烯丙基二硫（DADS）對(duì)DJ-1核定位高表達(dá)人白血病HL-60細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，闡明DJ-1在細(xì)胞核內(nèi)的功能，為腫瘤在臨床診斷及治療過(guò)程中提供一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)或有效藥物。
　　方法:通過(guò)lipo fectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶有DJ-1基因細(xì)胞核定位表達(dá)質(zhì)粒pCMV/myc/nuc-EGFP-DJ-1轉(zhuǎn)染至人白血病HL-60細(xì)胞中， G418篩選出穩(wěn)定DJ-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞系

2、，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光信號(hào)，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后DJ-1蛋白在細(xì)胞漿、核內(nèi)表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染成功后實(shí)驗(yàn)分三組：對(duì)照組（HL-60細(xì)胞）、空載體組及高表達(dá)組（DJ-1核定位高表達(dá)HL-60細(xì)胞），利用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原比色實(shí)驗(yàn)、Giemsa染色法、Transwell遷移侵襲小室實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、周期、分

3、化、遷移侵襲能力及核內(nèi)DJ-1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立穩(wěn)定DJ-1核內(nèi)高表達(dá)的HL-60細(xì)胞系。
　　測(cè)序結(jié)果證實(shí)，DJ-1基因的細(xì)胞核定位表達(dá)質(zhì)粒pCMV/myc/nuc-EGFP-DJ-1的插入序列與DJ-1全長(zhǎng)cDNA的GenBank序列完全一致。熒光顯微鏡觀察高表達(dá)組細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光信號(hào)。Western blot檢測(cè)高表達(dá)組細(xì)胞核內(nèi)DJ-1蛋白的表達(dá)量明顯增高，提示成功穩(wěn)定的DJ-1核內(nèi)

4、高表達(dá)HL-60細(xì)胞株。
　　2.DADS對(duì)DJ-1細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)的HL-60生物學(xué)行為的影響。
　　MTT法顯示：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯高于對(duì)照組和空載體組細(xì)胞（P<0.05）。DADS作用后，三組細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，且高表達(dá)組細(xì)胞增值抑制率明顯低于對(duì)照組和空載體組（P<0.05）。提示DADS具有抑制DJ-1核內(nèi)高表達(dá)的HL-60細(xì)胞增殖的作用，并且DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可促進(jìn)HL-60 細(xì)胞

5、增殖及降低DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制的作用。
　　軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞的相對(duì)集落形成率明顯高于對(duì)照組和空載體組（P<0.05），DADS作用后，三組細(xì)胞相對(duì)集落形成率均減低（P<0.05）。提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可以促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖，DADS具有抑制DJ-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞增殖的作用。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞S期百分率高于對(duì)照組和空載體組（P<

6、0.05），高表達(dá)組細(xì)胞 G1期細(xì)胞百分率明顯低于對(duì)照組和空載體組（P<0.05），提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖作用。DADS作用后，三組細(xì)胞G1期百分率均明顯提高（P<0.05），S期均明顯降低（P<0.05）， DADS作用后出現(xiàn)G1期細(xì)胞阻滯，提示DADS具有誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的能力。
　　間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示：DADS作用前，CD11b在三組細(xì)胞表面呈弱表達(dá)，CD33在高表達(dá)組的表達(dá)量明顯高于

7、對(duì)照組和空載體組；DADS作用后，三組細(xì)胞CD11b的表達(dá)明顯提高，CD33的表達(dá)明顯降低，提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可以抑制HL-60細(xì)胞分化，DADS具有誘導(dǎo)DJ-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞分化的作用。
　　NBT還原反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞的還原率明顯低于對(duì)照組和空載體組（P<0.05）；DADS作用后，三組細(xì)胞的還原率均明顯升高（P<0.05），提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可以抑制HL-60細(xì)胞分化，DADS具有誘導(dǎo)D

8、J-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞分化的能力。
　　Giemsa染色法顯示：與DADS作用前相比，DADS作用后，三組細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)分化現(xiàn)象，細(xì)胞體積減小，核出現(xiàn) U型、腎型和分葉改變，核漿比例降低，細(xì)胞核的染色變淺等。
　　遷移實(shí)驗(yàn)顯示：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組和空載體組（P<0.05）；DADS作用后，三組細(xì)胞遷移能力均明顯減弱（P<0.05），提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可以促進(jìn)HL-60細(xì)胞遷移，DADS

9、具有抑制HL-60細(xì)胞遷移的作用。
　　侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：DADS作用前，高表達(dá)組細(xì)胞穿膜數(shù)較對(duì)照組和空載體組明顯增多（P<0.05）；DADS作用后，三組細(xì)胞穿膜數(shù)明顯減少，侵襲能力均明顯減弱（P<0.05），提示DJ-1核內(nèi)高表達(dá)可以促進(jìn)HL-60細(xì)胞侵襲，DADS具有抑制DJ-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞侵襲的能力。
　　3.DADS對(duì)DJ-1核內(nèi)高表達(dá)HL-60細(xì)胞核內(nèi)DJ-1表達(dá)的影響
　　Western blot

10、檢測(cè)：與DADS作用前相比，DADS作用后，三組細(xì)胞核內(nèi)DJ-1蛋白均明顯減少（P<0.05），提示DADS（1.25 mg·L-1）具有抑制HL-60細(xì)胞核內(nèi)DJ-1蛋白表達(dá)的能力。
　　結(jié)論：
　　1.DJ-1核定位高表達(dá)具有促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖和遷移侵襲及抑制HL-60細(xì)胞分化的作用。
　　2.DADS可以誘導(dǎo)DJ-1核定位高表達(dá)的HL-60細(xì)胞分化及抑制遷移侵襲。
　　3.DJ-1核定位高表達(dá)可減弱DA