細胞內(nèi)酸化對白血病耐藥細胞P-糖蛋白的影響.pdf

1、背景：由P—糖蛋白(P—gp)介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥(MDR)是影響腫瘤化療效果的重要原因。臨床上白血病初次化療一般可取得較好的結(jié)果，但復(fù)發(fā)后產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞則療效較差。腫瘤細胞的MDR是由一種藥物誘發(fā)，引起對其它多種不同結(jié)構(gòu)的藥物同時產(chǎn)生交叉耐藥，導(dǎo)致一些聯(lián)合化療方案的失敗。多藥耐藥產(chǎn)生的機制比較復(fù)雜，其中P—gp的過度表達是最重要的原因。由MDR1基因編碼的P—gp具有復(fù)雜的膜轉(zhuǎn)運功能，可以利用ATP水解釋放的能量主動地將疏水親脂性

2、藥物轉(zhuǎn)運到細胞外，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度低于殺傷濃度；還可以使藥物再分布到非靶細胞器從而導(dǎo)致耐藥。多年來，對于逆轉(zhuǎn)MDR的研究大多局限于如何抑制或拮抗耐藥基因表達及耐藥相關(guān)蛋白功能方面，目前已有的鈣通道阻斷劑、鈣調(diào)蛋白抑制劑、類固醇激素、環(huán)孢霉素等藥物往往都由于高毒性或特異性差等原因難于應(yīng)用到臨床。近期有很多研究證實，細胞內(nèi)pH值增高是很多耐藥腫瘤細胞所具有的共同改變，這一特點為腫瘤MDR研究提供了一個新的方向。但耐藥腫瘤細胞內(nèi)pH值與P—

3、gp的關(guān)系仍不明確，這方面需要深入探討。 目的：本研究通過降低K562/A02耐藥細胞內(nèi)pH，觀察細胞酸化對P—gp的影響，探討耐藥腫瘤細胞內(nèi)pH值與P—gp的關(guān)系，為明確二者關(guān)系提供實驗依據(jù)，并且為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥提供新的方法。 方法：應(yīng)用高鉀緩沖溶液和鈉氫交換蛋白1(NHE1)的特異性抑制劑酸化細胞，降低細胞內(nèi)pH值。采用MTT法觀察高鉀緩沖溶液和NHE1的特異性抑制劑誘導(dǎo)的細胞內(nèi)酸化對細胞活力的影響。應(yīng)用激光共聚焦

4、顯微鏡測定K562及K562/A02細胞內(nèi)pH值。分別采用實時定量RT-PCR技術(shù)及Western blot檢測細胞酸化對P—gp的mRNA表達水平和蛋白表達水平的影響。應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞酸化對K562/A02細胞P—gp功能的影響。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞酸化對阿霉素在K562及K562/A02細胞內(nèi)累積和分布的影響，采用Western blot方法檢測酸化過程對p38，ERK，JNK蛋白激酶的影響。 結(jié)果：細胞酸化3

5、小時對K562及K562/A02細胞的活力影響較小。P—gp陰性的K562細胞的胞內(nèi)pH值顯著低于P—gp陽性的K562/A02細胞。細胞酸化還分別在蛋白水平和mRNA水平抑制了K562/A02細胞中P—gp的表達，并且這種抑制具有細胞內(nèi)pH及酸化時間的依賴性。在K562/A02細胞中，P—gp的功能隨細胞內(nèi)pH的降低而減弱，細胞酸化明顯增加了K562/A02細胞內(nèi)羅丹明123(Rh123)的累積，并抑制了P—gp介導(dǎo)的Rh123外排。

6、細胞酸化增加了K562/A02細胞內(nèi)阿霉素的累積，并且這種增加具有pH值依賴性，隨著酸化程度的加深細胞內(nèi)阿霉素的累積也逐漸增加，阿霉素在細胞核內(nèi)的分布也明顯增多。隨著細胞內(nèi)pH的降低，K562/A02細胞中p38蛋白激酶磷酸化水平呈下降趨勢，ERK蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢，JNK蛋白激酶磷酸化水平星上升趨勢。當(dāng)應(yīng)用ERK蛋白激酶抑制劑時，細胞酸化可誘導(dǎo)p38蛋白激酶磷酸化水平上升，對JNK蛋白激酶磷酸化水平未見影響。 結(jié)論：