人核糖體蛋白L6基因?qū)Π籽〖?xì)胞耐藥性的影響和作用機(jī)制的研究.pdf

1、白血病是最常見的腫瘤之一。當(dāng)前，白血病的治療依然以化療為主，盡管有高效的藥物，腫瘤細(xì)胞的耐藥依然嚴(yán)重影響化療療效。特別是多藥耐藥(MDR)是造成化療失敗和死亡的主要原因，研究白血病的多藥耐藥性及其臨床逆轉(zhuǎn)已成為腫瘤治療亟待解決的問題。對此人們已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，通過生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和基因?qū)W的方法確定耐藥的基礎(chǔ)和MDR相關(guān)基因。為克服MDR，了解獲得MDR的機(jī)制是非常必要的。目前發(fā)現(xiàn)的與MDR有關(guān)的機(jī)制有：藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過度表達(dá)、細(xì)胞解毒功

2、能增強(qiáng)、藥物作用靶點(diǎn)改變、細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能增強(qiáng)、細(xì)胞抗凋亡機(jī)制形成等，但這些都不足以解釋臨床多藥耐藥現(xiàn)象。據(jù)報道，有許多患者獲得性化療藥物抵抗，而無上述改變，提示尚有某些不為人知的機(jī)制參與耐藥形成。 真核細(xì)胞的大亞基和小亞基中約有80個核糖體蛋白，雖然已知參與蛋白質(zhì)的合成，但功能復(fù)雜，大部分核糖體蛋白的功能還未逐一研究，其確切的功能尚不清楚。在人類大多數(shù)腫瘤中都有核糖體蛋白發(fā)生改變，表達(dá)增高、降低或突變。越來越多的證據(jù)

3、顯示，眾多的核糖體蛋白有各種各樣的“第二”功能，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖、凋亡、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)、自身翻譯調(diào)節(jié)，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)等方面。文獻(xiàn)報道，人核糖體蛋白L6(RPL6)基因在某些耐藥腫瘤細(xì)胞表達(dá)增高，為此，通過RT-PCR和分子克隆技術(shù)從人白血病耐藥細(xì)胞系K562／AO2擴(kuò)增出：RPL6編碼區(qū)的完整序列，構(gòu)建RPL6正、反義真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入K562和K562／AO2細(xì)胞，探討核糖體蛋白L6與白血病細(xì)胞耐藥的關(guān)系，為

4、逆轉(zhuǎn)耐藥尋找新的方法。 第一部分核糖體蛋白L6基因在白血病細(xì)胞中表達(dá) 目的：觀察人RPL6基因在急性髓細(xì)胞性白血病(AML)多藥耐藥細(xì)胞系K562／AO2和敏感細(xì)胞系K562之間的以及在難治／復(fù)發(fā)和初治敏感的AML患者之間的表達(dá)。 方法:分別從K562／AO2和K562細(xì)胞以及難治／復(fù)發(fā)和敏感患者原代細(xì)胞中提取總RNA，通過半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出RPL6目的DNA片段，以β-actin為內(nèi)

5、對照比較RPL6基因表達(dá)。 結(jié)論：RPL6基因在白血病耐藥細(xì)胞K562／AO2和難治／復(fù)發(fā)患者表達(dá)增高，可能與白血病細(xì)胞耐藥有關(guān)。 第二部分人核糖體蛋白L6基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：通過克隆人RPt6 cDNA編碼區(qū)全長序列，構(gòu)建含人核糖體蛋白L6基因的正、反義真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步深入研究核糖體蛋白L6在白血病耐藥中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：從K562／AO2細(xì)胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合

6、酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增RPL6 cDNA片段編碼區(qū)全長序列。通過連接酶連入真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，以Knp I酶切篩選出正向插入和反向插入的重組質(zhì)粒，構(gòu)建出正義重組真核表達(dá)質(zhì)粒和反義重組真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。 結(jié)論：成功克隆了人RPL6 cDNA片序列，并構(gòu)建了正義和反義真核表達(dá)載體。 第三部分、核糖體蛋白L6基因?qū)Π籽〖?xì)胞耐藥性的影響 目的：觀察RPL6基因表達(dá)的改變對白血病細(xì)胞耐藥性的影響。

7、 方法：以脂質(zhì)體將正義RPL6 eDNA真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中，將反義RPL6 eDNA真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染到K562／A02細(xì)胞中，同時將空pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的細(xì)胞作為對照。以MTT檢測細(xì)胞對阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、米托葸醌(M／T)和依托泊苷(VPl6)耐藥性的作用，以高效液相色譜儀(HPLC)檢測阿霉素作用后各組細(xì)胞內(nèi)阿霉素積蓄量。 結(jié)論：R

8、PL6基因在白血病K562／A02細(xì)胞耐藥性的形成中起重要作用，增加人核糖體蛋白L6基因表達(dá)能增強(qiáng)K562細(xì)胞的耐藥性；抑制人核糖體蛋白L6基因表達(dá)能降低K562／A02細(xì)胞的耐藥性。 第四部分、核糖體蛋白L6基因?qū)Π籽〖?xì)胞耐藥性的作用機(jī)制 目的：觀察RPL6基因表達(dá)的改變對在阿霉素誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡的影響，探討RPL6基因影響耐藥可能的機(jī)制。 方法：以脂質(zhì)體將正義RPL6 eDNA真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3

9、.1(+)轉(zhuǎn)染到UK562細(xì)胞中，將反義RPL6 cDNA真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染到K562／A02細(xì)胞中，同時將空pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的細(xì)胞作為對照。以熒光分光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和熒光分光光度計觀察在阿霉素誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hochest33258染色后的凋亡形態(tài)改變、凋亡細(xì)胞百分率和Caspase-3活性的變化。 結(jié)論：RPL6基因過表達(dá)通過改變藥物誘導(dǎo)的凋亡在白血病K562／A02細(xì)胞耐藥性的形成中