PGI基因?qū)Π籽〉挠绊懞蜋C制的研究及Rh2對白血病影響的機制和抑制PGI的關(guān)系.pdf

1、背景及目的:
　　白血病是高發(fā)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。其特點為正常造血細胞受到某一類型的白血病細胞的抑制，骨髓或其他造血組織中白血病細胞惡性增生，浸潤體內(nèi)各組織臟器，產(chǎn)生各種臨床癥狀。治療以化療、骨髓移植為主，某些類型白血病化療耐藥，治療效果差，預(yù)后較差。
　　磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphoglucose isomerase，PGI)作為一種多功能蛋白廣泛存在于各種組織中，在細胞內(nèi)是催化糖酵解和糖異生途徑葡萄糖-6-磷酸酶與果

2、糖-6-磷酸酶之間的相互轉(zhuǎn)化的一種關(guān)鍵酶[1]。因為能被細胞分泌到胞外作用于周圍細胞發(fā)揮各種作用被稱作自分泌活動因子(autocrine motility factors，AMF)[2-4]。它的激活促進腫瘤細胞的生長、侵潤、轉(zhuǎn)移的活性。我們的前期研究表明，用人參多糖GPS作用于白血病細胞，其PGI基因能被明顯的抑制[5]。為研究下調(diào)PGI后與白血病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們構(gòu)建了共表達熒光蛋白和人PGI基因siRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染高表

3、達PGI基因的人白血病細胞，初步觀察RNA干擾PGI基因?qū)Π籽〖毎飳W(xué)特性的影響及其可能的機制，同時加入人參皂苷單體Rh2，觀察其對白血病細胞的作用與抑制PGI的關(guān)系。
　　方法:
　　第一部分
　　提取并收集人正常單核細胞，收集白血病細胞K562、KG1-α、HL60細胞，RT-PCR、Western Blot檢測PGI在人單核細胞及白血病細胞中的表達情況，篩選出高表達PGI的白血病細胞。構(gòu)建表達特異干擾PGI基

4、因siRNA的慢病毒質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，利用表達PGI siRNA的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達PGI的白血病細胞，RT-PCR、Western Blot檢測該白血病細胞中PGI的表達。
　　第二部分
　　利用cck-8檢測RNA干擾白血病細胞PGI基因后細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測RNA干擾白血病細胞PGI基因后細胞的周期分布和凋亡情況。Elisa檢測干擾后細胞外液PGI含量。Western blot檢測干擾后糖酵解途徑HK2、

5、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表達;Western blot檢測干擾后AMF下游PI3K-Akt途徑PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表達。
　　第三部分
　　用己糖激酶抑制劑3-BrPA和人參皂苷單體Rh2處理高表達PGI基因的白血病細胞，人參皂苷單體Rh2處理干擾后KG1-α細胞，Westernblot檢測糖酵解途徑HK2、PGI、LDHA、PKM2的蛋白表達;Westernblot檢測AMF

6、下游PI3K-Akt途徑PI3K、Akt、cyclinD1、caspase-3的蛋白表達，觀察Rh2是否通過PGI發(fā)揮作用。
　　實驗結(jié)果:
　　1、白血病細胞中PGI的mRNA和蛋白表達量明顯高于人單核細胞，其中以KG1-α細胞表達量最高。
　　2、成功構(gòu)建表達PGI siRNA的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后能使白血病細胞系KG1-α的PGI基因的mRNA及蛋白表達水平下調(diào)。干擾組PGI mRNA的抑制率為55.4％，

7、與陰性對照組比較，有明顯差異(P＜0.01);干擾組PGI蛋白的抑制率為83.1％，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、CCK8檢測KG1-α細胞增殖:白血病細胞在第5天出現(xiàn)增殖高峰。干擾組細胞增殖能力明顯低于陰性對照組。(P＜0.01)
　　4、流式細胞術(shù)檢測細胞周期:干擾組增殖指數(shù)為40.48±0.59％，明顯低于陰性對照組60.65±0.62％和空白對照組56.61±0.68％。(P＜0.05

8、)
　　5、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:干擾組細胞凋亡率23.00±0.65％，明顯高于陰性對照組3.94±0.48％和空白對照組4.92±0.33％。
　　6、Elisa檢測干擾后細胞外液PGI含量明顯降低。
　　7、western blot檢測干擾PGI后糖酵解途徑及PI3K/Akt途徑受到抑制。
　　8、western blot檢測Rh2作用后糖酵解途徑及PI3K/Akt途徑均受到抑制。
　　結(jié)論:

9、>　　1、PGI在白血病細胞中高表達，其中以KG1-α細胞表達量最高。
　　2、成功構(gòu)建了人PGI慢病毒質(zhì)粒并感染人白血病細胞系KG1-α，發(fā)現(xiàn)能有效抑制KG1-α細胞PGI基因mRNA和蛋白的表達。下調(diào)白血病細胞KG1-α中PGI的表達能降低細胞的增殖能力，能影響將細胞周期阻滯在G0/G1期，增加細胞凋亡。
　　4、下調(diào)PGI基因后能抑制細胞的糖酵解途徑。
　　5、下調(diào)PGI基因后能抑制細胞自分泌PGI/AMF，并抑