山羊β—乳球蛋白調控序列及增強子序列共指導人胰島素原基因表達的研究.pdf

1、利用人胰島素原基因組DNA與山羊乳蛋白調控序列、增強子序列以及新霉素抗性基因共同組成乳腺特異性表達載體，將此構件轉染山羊乳腺上皮細胞，經(jīng)激素誘導獲得了表達重組人胰島素的山羊乳腺上皮細胞系，從而為制備乳腺特異性表達轉基因山羊奠定了基礎。 一、乳腺特異性表達載體的構建 人胰島素原基因組DNA，以人的全血基因組DNA為模板經(jīng)高保真PCR擴增獲得，長度為1.2Kb，包含信號肽序列、A、B、C肽鏈序列DNA；β-乳球蛋白(BLG)

2、基因調控序列，以薩能奶山羊基因組為模板經(jīng)高保真長PCR擴增獲得，其中5'端長度為4.2Kb，3'端長度為1.8Kb；增強子序列為600bp左右，富含細胞轉錄因子結合位點DNA序列以及NEOr新霉素抗性基因。通過以上元件，成功構建了奶山羊β-乳球蛋白調控序列及增強子序列共同指導人胰島素原基因乳腺特異性表達載體BIC13。 二、山羊乳腺上皮細胞系的建立與藥物篩選 采用膠原酶和透明質酸酶消化法從處于泌乳狀態(tài)的薩能奶山羊的乳腺組

3、織中分離得到原代乳腺上皮細胞，將乳腺特異性表達載體片段BLG5'-Enhancer-hPI-NEOr-BLG3'(9.7Kb)電轉染入第四代奶山羊乳腺上皮細胞，經(jīng)含400μg/mlG418的篩選培養(yǎng)液篩選三周后，得到10個有抗性的細胞株。提取細胞基因組，經(jīng)PCR擴增表明，其中有6個細胞株成功轉染了外源基因。 三、陽性乳腺上皮細胞系的誘導表達與檢測 對轉染有外源基因的細胞株進行擴大培養(yǎng)，同時用催乳素誘導表達，48小時后提取