人載脂蛋白(a)基因簇增強子體內檢測系統(tǒng)構建.pdf

1、人載脂蛋白(a)[apolipoprotein (a),apo(a)]基因簇是研究真核基因表達調控的良好模型,而且其研究結果對臨床有指導作用.升高的血漿脂蛋白(a)[lipoprotein (a),lp(a)]水平為動脈粥樣硬化的一個主要危險因素,而研究表明它的表達水平主要由apo(a)的表達水平決定.基于目前眾多的用于篩選和鑒定DNA調節(jié)片段的方法,我們采用了重組酶介導的片段交換(recombinase-mediated casset

2、te exchange,RMCE)技術,利用重組酶的位點特異性重組特性,在基因組內的特定位點有效地進行靶片段與目的片段的交換.經典的RMCE過程分為以下三個步驟(1)靶載體(target vector)隨機整合在細胞基因組上,靶片段的兩側為互為非相容性(mutually incompatible)的兩種Lox序列,它們僅僅間隔區(qū)不同;(2)交換載體(exchange vector)與Cre重組酶表達載體共轉染基因組內整合有靶載體的細胞株

3、;(3)在重組酶介導下,交換載體上兩種Lox序列間的交換片段與靶載體上的靶片段發(fā)生交換,實現(xiàn)在基因組的同一位點上交換片段的整合.通過Cre介導的RMCE技術,產生基因組的特定位點(artificial genomic loci,AGL),可以在特定的染色質環(huán)境下研究調控序列的作用機制,隔離子的功能,染色質的位置效應以及高效表達目的蛋白質等.該實驗首先設計有相應酶切位點的引物,從人Apo(a)-Plasminogen基因簇BAC(DH 1

4、0B株)中擴增apo(a)啟動子序列,與質粒pL1-HYTK-1L-SV40-EGFP-Neo進行定向連接,在報告基因EGFP和Neo的編碼序列上游以313bp apo(a)啟動子的核心序列替換SV40啟動子.在該實驗篩選出的穩(wěn)定轉化HYG<'r>-HepG2細胞系的基礎上,可以進一步構建立換載體,行脂質體轉化,GCV負篩選,流式細胞儀分析,進行apo(a)基因簇順式元件(主要為增強子)的篩選和鑒定.同時這也是構建細胞芯片的基礎步驟:細

5、胞芯片技術是新近發(fā)展起來的一種高通量轉化技術,利用反向轉化的原理,在芯片上點樣(載有交換片段的交換載體DNA)后,將細胞培養(yǎng)在芯片上攝入外源DNA,在芯片的原位檢測轉化信號,進行大規(guī)模的轉化分析,從而進行高通量的順式元件的功能分析.該實驗在HepG2細胞中整合攜帶有互為反向Lox位點的靶載體,獲得的HYG<'r>-HepG2細胞株,可作為受體細胞株(recipient cell strains)用于在特定的染色質環(huán)境下順式作用元件的大規(guī)