人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3基因編碼序列的克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)是一種多功能的內(nèi)分泌因子，是該家族的重要成員，是人類血液中數(shù)量最多、作用最強的IGFBP，可結(jié)合血液中95％-99％的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)。重組人IGF-1(rhIGF-1)早已被應(yīng)用于治療侏儒癥，并發(fā)現(xiàn)IGF-1對于糖尿病、神經(jīng)損傷、和骨質(zhì)疏松癥也有治療作用。但已有報道證明單獨應(yīng)用rhIGF-1治療時，可引發(fā)一些輕度和中度不良反應(yīng)，包括四肢浮腫、頭疼、關(guān)節(jié)疼、下顎觸痛、體位性低

2、血壓、視神經(jīng)水腫等。IGFBP-3可使IGF-1的半衰期延長，控制IGF-1的生物利用度而使不良反應(yīng)顯著減少。rhIGF-1和rhIGFBP-3合并成復(fù)合物使用，當(dāng)可成為提高藥效降低副作用之最佳方案。而后者也有望被開發(fā)為一種新藥，并具有廣泛的應(yīng)用前景。與此同時多年研究確認(rèn)IGFBP-3是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)物，這一作用是獨立于IGFs之外的。IGFBP-3具有促細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長、增強癌細(xì)胞的放射敏感性等作用，IGFBP-3對生長失控細(xì)胞

3、的作用機制，已成為抗腫瘤治療研究的一個新熱點。而國內(nèi)對于IGFBP-3的研究，僅限于將其作為糖尿病、腫瘤等的標(biāo)志物，而對于表達純化及功能方面的報道甚少。
　　 我實驗室已成功構(gòu)建了IGF-1的高效表達系統(tǒng)。本文目的旨在建立IGFBP-3的原核表達系統(tǒng)，為進一步深入研究IGFBP-3提供條件。我們提取人肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴增IGFBP-3的cDNA，經(jīng)巢式PCR擴增得到目的片段。將其克隆入pGEM-T Easy載體

4、。測序證實序列正確后，將目的基因插入融合型原核表達載體pQE-30Xa，將已構(gòu)建好的表達載體pQE-30Xa/IGFBP-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，異丙基硫代-8-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達。采用親和層析法純化目的蛋白。ELISA法測定rhIGFBP-3與IGF-1的結(jié)合活性。MTT法檢測rhIGFBP-3對Hela細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果SOS-PAGE可見與預(yù)期大小相符的蛋白條帶，Western Blot證實該條帶即為rhIG