胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6的功能研究.pdf

1、由于IGF家族重要的生長調(diào)節(jié)作用，對IGFBP家族活性的研究成為近年來該領(lǐng)域的研究熱點，并發(fā)現(xiàn)了這一家族蛋白越來越多的生物活性。其中，IGFBP-6是IGFBP家族中發(fā)現(xiàn)最晚、被研究的較少的蛋白，但IGFBP-6是IGF-Ⅱ的高親和力結(jié)合蛋白，對IGF-Ⅱ活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。IGFBP-6所具有的抑制IGF-Ⅱ促腫瘤生長活性的作用已經(jīng)在很多腫瘤細胞系中得到了證實。IGFBP-6在體內(nèi)廣泛的分布及其與IGF-Ⅱ的特殊關(guān)系表明對其活性的

2、研究具有重要的意義。本論文的研究工作從以下方面對IGFBP-6的功能進行了研究。 首先在酵母表達體系中分泌表達了重組人IGFBP-6，分離純化得到了純品，檢測了活性，并對IGFBP-6在真核細胞中的分布做了初步的研究。 1.成功構(gòu)建了三拷貝的酵母表達載體pA0815-3IGFBP-6，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，篩選到了高表達產(chǎn)量的菌株，優(yōu)化了表達條件。 2.成功分離純化了IGFBP-6表達上清，得到了純度大于90％的I

3、GFBP-6。 3.檢測了IGFBP-6抑制IGF-Ⅱ促腫瘤細胞A549增殖的活性。 4.利用免疫熒光實驗和EGFP融合蛋白轉(zhuǎn)染實驗，首次觀察到了IGFBP-6可以進入細胞，以及在細胞核中的分布。提示IGFBP-6具有在細胞內(nèi)的不依賴IGF-Ⅱ的生物活性。 其次，利用酵母雙雜交系統(tǒng)3篩選了小鼠腦cDNA文庫，得到了兩個能夠與IGFBP-6相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)過生物信息學(xué)的分析，確定了這兩個蛋白質(zhì)分別是鋅指蛋白KI

4、AA0530和泛素融合蛋白UBA52。 另外，研究了IGFBP-6在IGF-Ⅱ翻譯加工及分泌表達過程中可能的作用機制。 1.構(gòu)建了IGFBP-6與IGF-Ⅱ共表達的酵母表達載體pA0815-2(IGF-Ⅱ-IGFBP-6)，轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，篩選到了共表達IGF-Ⅱ和IGFBP-6的陽性菌株，進行了搖瓶規(guī)模表達條件的優(yōu)化。 2.檢測了共表達產(chǎn)物中IGF-Ⅱ的二硫鍵的折疊情況，得到了二硫鍵正確折疊的IGF-Ⅱ，解

5、決了IGF-Ⅱ單獨表達時二硫鍵不能正確折疊的問題。 3.成功純化出了結(jié)合狀態(tài)的IGF-Ⅱ和IGFBP-6復(fù)合物，為進一步研究IGF-Ⅱ與IGFBP-6的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。 通過上述工作，首次報道了在畢赤酵母中分泌表達IGFBP-6，觀察到了IGFBP-6可以進入細胞，并且在細胞核中有所分布。初步篩選到了能夠與IGFBP-6相互作用的蛋白，為進一步深入研究IGFBP-6在細胞內(nèi)的生物活性奠定了基礎(chǔ)。并提供了IGFBP-