人胰島素原基因的克隆以及在大腸桿菌中的高效表達(dá)、質(zhì)譜鑒定.pdf

1、隨著糖尿病人的不斷增多，人胰島素做為最主要的治療藥物，其需求量越來(lái)越大。同時(shí)，做為糖尿病病因檢查的人胰島素檢測(cè)試劑盒的需求也越來(lái)越廣泛。重組人胰島素是第一個(gè)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因藥物，修飾重組胰島素因其更為優(yōu)越的治療效果而在逐步占領(lǐng)糖尿病治療市場(chǎng)。通過(guò)基因工程手段生產(chǎn)的重組人胰島素主要以含人胰島素原基因的大腸桿菌發(fā)酵得到。真核基因在大腸桿菌系統(tǒng)直接表達(dá)時(shí)往往產(chǎn)率較低，由此造成生產(chǎn)成本增加。本文以前期設(shè)計(jì)、合成的適合在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的人胰島

2、素原基因?yàn)椴牧?，亞克隆該基因至表達(dá)載體pGEX-3X和pET-32a，分析了該基因在E.coli中的適宜表達(dá)條件，獲得了可高效表達(dá)人胰島素原的工程菌株和培養(yǎng)條件。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴使用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI酶切重組質(zhì)粒 pBluscript-hPINS，分離人胰島素原基因片段，該片段的長(zhǎng)度為275bp。將人胰島素原基因亞克隆至表達(dá)載體 pGEX-3X，經(jīng) DNA序列測(cè)序核實(shí)獲得的重組表達(dá)載體pGEX-Ins。

3、該重組表達(dá)載體的大小為5227bp，所編碼的重組融合蛋白大小為35kDa。⑵重組表達(dá)載體pGEX-Ins轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coliBL21（DE3）和E. coliBL21 star(DE3)，構(gòu)成表達(dá)重組蛋白的穩(wěn)定菌株。從表達(dá)菌株、生長(zhǎng)溫度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間五個(gè)方面優(yōu)化其表達(dá)條件，最終確定重組人胰島素原蛋白的適宜條件為：表達(dá)菌株E. coliBL21 star(DE3)、大腸桿菌的生長(zhǎng)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)菌密度OD550

4、≧0.5、誘導(dǎo)溫度為26℃、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為2mmol/L。大量表達(dá)重組人胰島素原蛋白，收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，SDS-PAGE分析上述條件表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在。提取和純化包涵體后，重組蛋白占包涵體蛋白的80.5％。重組蛋白的得率為38.8mg/L。重組蛋白經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定后結(jié)果顯示GST被誘導(dǎo)表達(dá)，而GST之后的人胰島素原被一未知多肽替換，堿基序列再次測(cè)定后并未發(fā)現(xiàn)移碼突變和堿基突變，其序列的基因順序和起始重組質(zhì)粒

5、pGEX-Ins完全一致。⑶以重組載體pGEX-Ins為模板，PCR擴(kuò)增人胰島素原基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為273bp?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物后亞克隆至表達(dá)載體 pET-32a，構(gòu)建表達(dá)載體 pET-Ins。該重組表達(dá)載體的大小為6173bp，所編碼的重組蛋白大小為28kDa。⑷重組表達(dá)載體pET-Ins轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），含重組蛋白的菌株，從生長(zhǎng)溫度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間四個(gè)方面優(yōu)化其表達(dá)條件。重組人胰島素原基因

6、的適宜表達(dá)條件為：大腸桿菌的生長(zhǎng)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)菌密度OD550≧0.5、誘導(dǎo)生長(zhǎng)溫度為26℃、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為1mmol/L。大量表達(dá)重組人胰島素原蛋白，收集菌體，超聲破碎菌體細(xì)胞，SDS-PAGE分析表達(dá)重組蛋白主要以包涵體的形式存在。提取和純化包涵體后，重組蛋白占包涵體總蛋白的89.9%。重組蛋白條帶經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示該重組蛋白含有人胰島素原。⑸將人胰島素原基因克隆至pGEX-3X的GST標(biāo)簽蛋白之后BamHI和

7、EcoRI位點(diǎn)，通過(guò)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，確定表達(dá)載體pGEX-Ins序列的準(zhǔn)確性。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌獲得穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的菌株。通過(guò)誘導(dǎo)該基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，進(jìn)而分離純化得到重組人胰島素原蛋白。該蛋白經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定后發(fā)現(xiàn) GST之后的目的蛋白被一未知多肽所代替。對(duì)表達(dá)載體重新測(cè)序鑒定后發(fā)現(xiàn)基因序列并未發(fā)生移碼突變或堿基突變，其原因還需要進(jìn)一步的研究。將人胰島素原基因擴(kuò)增后亞克隆至pET-32a的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，