酪蛋白-巨細胞病毒（CMV）復合啟動-增強子指導人乳鐵蛋白cDNA表達的研究.pdf

1、轉基因動物乳腺生物反應器為獲得高質量、低成本的藥用重組人乳鐵蛋白提供可能。但是，人乳鐵蛋白在轉基因動物乳腺中仍多處于較低水平表達。為此，本研究構建了一對乳腺特異性表達載體，制備了轉基因小鼠，通過比較兩種不同構件(即是否含有CMV增強子部分)，探討添加CMV增強子對于提高人乳鐵蛋白乳腺特異性表達水平的作用；并且摸索在個體水平篩選轉基因高表達個體的方法。 本研究之構建選用牛α s1-酪蛋白的調控序列，包括長2264bp5’端調控區(qū)，

2、即含第2外顯子起始ATG前部分、第1內含子、第1外顯子、5’端上游+818bp序列：共長1440bp的3’端調控區(qū)，包括最后外顯子(第18外顯子)部分、最后內含子(第18內含子)、3’端非翻譯區(qū)；另外上游拼接了富含ATG的4kb部分，從-2264bp到-6264 bp處。具體序列見GENBANK(登錄號X59856)。通過Xhol酶切PG-LF質粒(實驗室保存)獲得hLF cDNA片段(約2.3kb)，共同構建了由牛α sl-酪蛋白5’

3、端+hLF cDNA+牛αsl-酪蛋白3’端構成人乳鐵蛋白cDNA乳腺特異表達載體AF；在AF’構建基礎上，從質粒pCEP4載體切下含增強子CMV的DNA片段，由牛α sl-酪蛋白5’端+增強子片段+hLF cDNA+牛α-sl-酪蛋白3’端構建成人乳鐵蛋白cDNA乳腺特異表達載體AP。 將AP質粒用Sal1與Not1限制性內切酶消化，回收純化約11kb的真核表達載體片段。選用C57♂與ICR早進行交配，獲得受精卵1491枚，通

4、過原核顯微注射法將表達載體片段導入小鼠受精卵雄原核，注射后存活卵數(shù)(移植數(shù))630枚，移植受體數(shù)37只，受體懷孕數(shù)13只，獲得出生仔鼠51只，受精卵存活率為42.3％； AF構件的質粒用上述同樣方法處理后，制備轉基因小鼠，獲得受精卵851枚，通過原核顯微注射法將表達載體片段導入小鼠受精卵雄原核，注射后存活卵數(shù)(移植數(shù))490枚，移植受體數(shù)20只，受體懷孕數(shù)15只，獲得出生仔鼠56只，受精卵存活率為57.6％。通過PCR檢測和PC

5、R產(chǎn)物測序，2只AP小鼠整合有外源基因(♀46<'＃>、♀42<'＃>)，轉基因整合率為3.9％。轉基因原代小鼠與正常小鼠交配，獲得F1代整合小鼠5只，F(xiàn)2代整合小鼠7只，建立人乳鐵蛋白轉基因小鼠品系。 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA assay)和蛋白印跡(Western Blot)對AP原代轉基因小鼠及其后代的乳汁表達水平進行檢測。ELISA檢測結果表明：在AP轉基因原代小鼠和F1、F2代乳汁中人乳鐵蛋白表達均呈陽性，其中原代表

6、達量約在3～6g·L<'-1> Westem Blot結果表明：轉基因小鼠乳清檢測有與標準人乳鐵蛋白帶相一致的條帶。此外，轉基因小鼠血液、淚液的ELISA檢測結果顯示，所構建的表達載體具有乳腺特異性。對AF轉基因小鼠乳汁收集，送至江蘇省原子醫(yī)學研究所檢測，檢測結果實驗室保存。 通過近交篩選，獲得AP轉基因純合子小鼠(♀38<'＃>、♂36<'＃>)，催乳獲得小鼠乳汁，ELISA檢測乳汁中人乳鐵蛋白有較高表達量。同時利用本實驗室已

7、獲得的PCL25轉基因小鼠(♀2<'＃>)，篩選獲得純合子小鼠(♀18<'＃>)，兩品系遠交，篩選獲得雙重雜合子小鼠。 比較AF與AP，后者在前者的基礎上增加了CMV增強子；在轉基因小鼠個體表達水平上，后者明顯高于前者。此試驗結果證實了我們的設想，即牛的α sl-酪蛋白調控序列與CMV增強子復合啟動子構建乳腺特異性表達載體，能夠大大提高人乳鐵蛋白cDNA的表達。本實驗還表明，我們所構建的人乳鐵蛋白乳腺特異性表達載體具有很好的乳腺