強力霉素調控的重組人胰島素原基因載體的構建及體外表達研究.pdf

1、目的：基因治療過程中,所表達的目的基因產(chǎn)物需要有量的控制,如果持續(xù)表達則可造成表達產(chǎn)物過量,引起毒副作用,對機體造成不良影響,對胰島素基因治療尤其是如此.為此,該研究構建了單質粒的強力霉素調控的胰島素基因表達轉移載體系統(tǒng),以便定量調節(jié)胰素基因在C2C12細胞中的表達.方法：該研究采用了四環(huán)素基因調控表達系統(tǒng)質粒作為基因表達的載體.四環(huán)素調控系統(tǒng)分為tet-off和tet-on兩型,該研究采用了tet-on系統(tǒng).通過基因重組,將四環(huán)素調控

2、表達系統(tǒng)的兩個質粒pUHrT2-1和pUHC13-9改造成單一的質粒,并將重組的胰島素原基因克隆入此表達系統(tǒng)成為四環(huán)素調控的胰島素基因轉移載體（prTR-tetO-mINS）.通過脂質體轉染法,將prTR-tetO-mINS和pLNCX（含neo基因）共同轉染入成肌細胞系C2C12,同時以pLNCX為對照.轉染后3天加入G418,篩選7天,形成陽性克隆,將G418濃度減半繼續(xù)培養(yǎng)7天,然后分別以0、2、10μg/ml濃度的強力霉素誘導.