利用油菜油體系統(tǒng)表達(dá)重組人胰島素原的研究.pdf

1、糖尿病(diabetes)是一組以由胰島素分泌和(或)胰島素作用缺陷引發(fā)的以高血糖為特征的代謝疾病，受遺傳和環(huán)境因素影響；糖尿病并發(fā)癥包括大血管病變和微血管病變引起的腦卒中、失明和截肢等嚴(yán)重后果，糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重地影響著人類健康和生活質(zhì)量；胰島素是目前臨床糖尿病治療最有效最安全的一線藥物，隨著糖尿病發(fā)病率的不斷攀升，胰島素的市場(chǎng)需求量也不斷增加，胰島素的生產(chǎn)和研究呈現(xiàn)廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。
　　 從1922年世界上第一例糖尿

2、病患者應(yīng)用胰島素治療獲得成功至今，在臨床使用胰島素已有近90年的歷史。目前，市場(chǎng)上胰島素藥物主要來源于微生物發(fā)酵生產(chǎn)和組織提取，存在著體外加工程序復(fù)雜、成本高、純度低、易污染等缺點(diǎn)。植物系統(tǒng)生產(chǎn)藥用蛋白日益受到重視，是一個(gè)安全廉價(jià)的生產(chǎn)系統(tǒng)；而植物油體系統(tǒng)利用油體蛋白的高表達(dá)和易分離特性，改進(jìn)了植物生物反應(yīng)器下游加工技術(shù)，降低了高純度藥用蛋白的生產(chǎn)成本。油體表達(dá)系統(tǒng)作為藥用蛋白的新來源，將得到逐步的完善及更廣泛的應(yīng)用。
　　 本

3、研究利用油菜表達(dá)重組人胰島素原，為臨床糖尿病治療提供了新思路，為利用植物油體系統(tǒng)表達(dá)其他具有重要價(jià)值的藥用蛋白提供了技術(shù)和理論的準(zhǔn)備。所取得的結(jié)果如下：
　　 1.基因合成和載體構(gòu)建：從滬油15(Brassica nape cv.Huyou15)中克隆oleosin啟動(dòng)子和油體蛋白(BN-V)基因，按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成重組人胰島素原基因(mins)，并將其連接于oleosin基因下游構(gòu)建融合基因。為便于外源蛋白檢測(cè)和純化，在

4、油體蛋白基因前端引入6個(gè)組氨酸的histag，并最終構(gòu)建植物種子特異性表達(dá)載體op：：his-og-mins-2300-twin；
　　 2.工程菌制備：用凍融法將表達(dá)載體op：：his-og-mins-2300-twin質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05中，PCR檢測(cè)結(jié)果證明成功獲得了EHA105工程菌；
　　 3.油菜遺傳轉(zhuǎn)化：用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化油菜下胚軸，在含卡那霉素(

5、40mg·L-1)培養(yǎng)基上篩選獲得160株抗性植株，PCR檢測(cè)8株為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為5％；
　　 4.基因整合：Southem blot結(jié)果證實(shí)有8株獨(dú)立轉(zhuǎn)基因油菜，靶基因hom在轉(zhuǎn)基因油菜基因組中整合拷貝數(shù)為2-5；
　　 5.轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)：半定量RT-PCR結(jié)果顯示，靶基因hom在3株獨(dú)立轉(zhuǎn)基因油菜植株的成熟種子中成功表達(dá)；
　　 6.蛋白水平表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示在2株轉(zhuǎn)基因油菜成熟種子中檢測(cè)