基于Cre-loxp重組系統(tǒng)的人胰島素原基因植物表達載體的構(gòu)建及其對煙草和玉米的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、最近幾年，植物作為生物反應(yīng)器已經(jīng)出現(xiàn)了讓人欣喜的研究成果，并且取得了顯著進步。低生產(chǎn)消耗、高產(chǎn)品安全性、容易收集等優(yōu)點，為植物反應(yīng)器的快速發(fā)展提供了強大的驅(qū)動力。如今，利用植物反應(yīng)器已經(jīng)生產(chǎn)了各種各樣的產(chǎn)品，如疫苗抗原，醫(yī)用診療蛋白、工業(yè)蛋白、營養(yǎng)補充品（抗物質(zhì)、維生素、碳水化合物和生物聚合物）等。
　　20年來，糖尿病以10倍的增長率擴張，糖尿病也成了影響人類健康的重大疾病之一。糖尿病和其并發(fā)癥嚴重影響了人的身心健康，給患者自己

2、，家庭和社會帶來相當大的經(jīng)濟負擔。臨床上，胰島素被用來治療Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，它不僅可以降低血糖，還可以影響糖的代謝，糖原異生，糖原合成，減少糖原分解，加快葡萄糖的有氧氧化和無氧酵解。伴隨著糖尿病患者數(shù)量的快速增加，胰島素的需求量將會快速上升。
　　我們實驗室根據(jù)植物密碼子的偏好性改造了人胰島素原的基因序列，改變了胰島素原的幾個氨基酸，使胰島素原變?yōu)殚L效胰島素原和速效胰島素原。改造后的胰島素原序列和原始胰島素原序列的末端添加了

3、Flag標簽，方便后續(xù)蛋白的檢測和純化。將鄭玲博士構(gòu)建的pCAMBIA230卜pRUBP proinsulin和pCAMBIA2301-RD29A-Cre雙菌共轉(zhuǎn)化的方法侵染煙草。該植物表達載體的特點是以pCAMBIA2301為骨架，在多克隆位點插入擬南芥的pRUBP強啟動子和胰島素原基因，在抗性基因NptⅡ加入了Cre重組酶的識別位點loxp序列，構(gòu)建成pCAMBIA2301-pRUBP-proinsulin植物表達載體;擬南芥誘導(dǎo)型

4、啟動子序列RD29A和Cre重組酶插入到植物表達載體pCAMBIA2301，構(gòu)建了pCAMBIA2301-RD29A-Cre植物表達載體。利用含有Cre的表達載體和pCAMBIA230卜pRUBP-proinsulin植物表達載體，雙菌共轉(zhuǎn)化的方法獲取表達雙載體的陽性煙草植株。經(jīng)過PCR檢測，GUS報告基因分析獲得轉(zhuǎn)基因煙草4株。
　　利用pCAMBIA3301植物表達載體骨架，構(gòu)建成3種pCAMBIA3301-35S-proin