含可調(diào)控人胰島素原基因質(zhì)粒的包裝增殖及鑒定.pdf

1、目的 T1DM是一種自身免疫性疾病,現(xiàn)在的治療手段主要是注射外源胰島素或胰腺(胰島)移植來維持正常的血糖水平.但是這兩種方法均存在不可避免的缺點(diǎn).隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在克服了技術(shù)問題,道德倫理問題和調(diào)控機(jī)制的人工操作問題后,將成為T1DM治療的最佳選擇.T1DM的轉(zhuǎn)基因治療目前仍處于試驗(yàn)階段,其基本過程分以下六個(gè)步驟:(1)人胰島素原基因的獲取;(2)連接調(diào)控元件并與載體連接;(3)重組質(zhì)粒導(dǎo)人包裝細(xì)胞;(4)篩選出含重

2、組DNA分子的受體細(xì)胞克隆;(5)克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化;(6)動(dòng)物實(shí)驗(yàn).該實(shí)驗(yàn)在重組質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上,主要進(jìn)行第(3)、(4)步操作,即將含人胰島素原基因(其上游連接有兩個(gè)調(diào)控元件:LPK基因啟動(dòng)子中的GIRE和IGFBP-1基因啟動(dòng)子)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)人PA317包裝細(xì)胞系,并采用NIH3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度,篩選出一株高效特異的產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆,為下一步的細(xì)胞水平和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ).從而為同類試驗(yàn)探索

3、出一條成熟的技術(shù)路線.方法 該試驗(yàn)根據(jù)前試驗(yàn)所采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN的特點(diǎn),選用PA317包裝細(xì)胞系并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)pLXsN進(jìn)行包裝,利用NIH3T3細(xì)胞篩選出一株高滴度產(chǎn)病毒細(xì)胞克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)并取其病毒上清,最后應(yīng)用酚-氯仿-異戊醇抽提DNA方法分別提取PA317和pLXSN的細(xì)胞基因組DNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,檢查有無目的基因片段.結(jié)論 含調(diào)控基因的人胰島素原重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后

4、,如欲進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),必須大量制備該基因重組體,以保證充足的來源.該實(shí)驗(yàn)針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn),選用PA317包裝細(xì)胞系采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pLXSN成功導(dǎo)入,并利用NIH3T3細(xì)胞篩選出一株高滴度產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317/pLxsN,并通過提取細(xì)胞DNA,PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳證明已穩(wěn)定整合于PA317細(xì)胞基因組上,其結(jié)構(gòu)正確.成功構(gòu)建的細(xì)胞株可以源源不斷產(chǎn)生大量的含基因重組體的復(fù)制缺陷型病毒,從而為下一步細(xì)胞水平及動(dòng)物水平研究鋪平