骨骼肌胰島素基因表達(dá)和調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文骨骼肌胰島素基因表達(dá)和調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究姓名：蘇本利申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：呂申20040601準(zhǔn)確性。(2)構(gòu)建prTA—tet4m／NS用砑o(jì)I和H／ndIII酶切prtTA2—1質(zhì)粒，將得到的PhCMVrtTA21／poly(A)片段插入到經(jīng)姍oI酶切的ptet—mINS質(zhì)粒，得到prTAtet4m／NS質(zhì)粒。(3)建成prTA—tet4rhlNS用ScaI和BamHI酶切pLNCX

2、質(zhì)粒，將所得到的無功能5’LTR礦NeoT片段插入到經(jīng)姍oI酶切的prTAtet4mINS上得到最終的prTA—tet4一rhlNS質(zhì)粒。直接測(cè)序其正確無誤。(4)質(zhì)粒導(dǎo)入成肌細(xì)胞系用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移法將prTAtet4rhlNS和pLNCX(一種含有新霉素抗性基因，但不含胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因克隆、表達(dá)質(zhì)粒)導(dǎo)入同一成肌細(xì)胞系(C2C。2)細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)氨基糖薔(G418，一種新霉素類似物)篩選后，以不同濃度(099／ml、2I_tg／ml

3、及101ag／m1)的強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)成活細(xì)胞，檢測(cè)誘導(dǎo)后第1、3、5、7天及撤藥后第1，3及5天培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物的胰島素(原)水平。留取第5天培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行胰島素原mRNA檢測(cè)。用放射免疫分析(RIA)測(cè)定胰島素(原)水平。C!C。z細(xì)胞內(nèi)人胰島素原mRNA用反轉(zhuǎn)錄一多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RTPCR)檢測(cè)。2骨骼肌注射的prTAtet4rhlNS對(duì)不同種系STZ糖尿病小鼠血糖的作用①用大腸桿菌擴(kuò)增、堿裂解法提取及聚乙二醇法純化質(zhì)粒

4、prTA—tet4rhINs和pLNCX：②腹腔內(nèi)注射STZ(150mg／kg)制各Balb／C和昆明種小鼠糖尿病模型(血糖蘭167mmol／L，持續(xù)2周以上)；③經(jīng)皮向小鼠雙側(cè)后腿骨骼肌內(nèi)各注射prTAqet4一rhlNS質(zhì)粒150／ag，共30099(治療組)，注射pLNCX質(zhì)粒者為對(duì)照組，同時(shí)使小鼠分別飲服濃度為O5∥L和29m的Dox水，尾尖取血，測(cè)定每日上午8時(shí)隨機(jī)血糖(葡萄糖氧化酶試紙法)，并稱量小鼠體重；④血糖穩(wěn)定下降的第

5、6天，斷頭處死部分小鼠，留取全血、注射部位的骨骼肌及肝臟組織，測(cè)定血清人胰島素(RIA)和C肽(免疫放射定量分析，iRMA)水平以及注射部位小鼠骨骼肌人胰島素原mRNA(RTPCR)。3電穿孔技術(shù)prTAtet4thiNS肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)和降血糖的增強(qiáng)作用①制備昆明小鼠糖尿病模型(方法同前)。②分單純肌肉注射prTA—tet4rhINS組(單純注射組，24只)、肌肉注射prTAtet4rhlNS后電穿孔增強(qiáng)組(電穿孔組，48只)和肌肉注射pLN