甘蔗乙烯受體基因SoERS1表達、轉(zhuǎn)化及啟動子序列的研究.pdf

1、甘蔗為重要的糖料作物和經(jīng)濟作物，通過培育新品種，結(jié)合栽培技術來提高甘蔗糖分、產(chǎn)量、抗逆性，是甘蔗糖業(yè)的主要發(fā)展方向。乙烯在植物生長發(fā)育過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，對乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑及其相關基因已有不少研究，獲得了多個受體基因，但對受體基因調(diào)控機理尚未清楚。乙烯利能夠顯著提高甘蔗的產(chǎn)量、蔗糖分、抗逆性，但其作用分子機理也未明確。因此，本實驗以新臺糖22號為材料，進行了甘蔗乙烯受體基因SoERS1表達、遺傳轉(zhuǎn)化和啟動子序列研究。主要結(jié)果如下:<

2、br>　　 1.SoERS1表達分析。在伸長期和工藝成熟期，葉片中SoERS1基因的表達為成熟葉＞幼葉＞老葉。在蔗莖中，老莖的表達量大于幼莖和成熟莖，伸長期成熟莖大于幼莖，而工藝成熟期成熟莖低于幼莖。在生理成熟期甘蔗不同組織部均能檢測到SoERS1基因的表達，說明該基因可能為組成型表達模式。干旱脅迫和黑暗條件下可以抑制成熟葉中SoERS1基因的表達;100 mg/L乙烯利處理伸長期甘蔗，成熟葉中SoERS1在第1d基因表達量急劇升高。

3、在苗期進行6℃低溫脅迫，葉中SoERS1的表達先降后升，低溫脅迫后恢復生長2d，基因的表達回升。
　　 2.植物表達載體構建。根據(jù)本課題組前期從新臺糖20號(ROC20)中克隆出甘蔗乙烯受體基因(GQ369007)序列，在其編碼區(qū)設計特異引物，并從新臺糖22號(ROC22)中克隆到ERS基因完整編碼框序列，基因命名SoERS1。在上、下游引物分別加XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點，構建SoERS1正義表達載體pBIERS。利用軟件Si

4、RNATarget Finder預測和分析SoERS1基因siRNA干擾片段，最終選定編碼區(qū)前403 bp，將該片段分別正向、反向插入中間載體176中，再用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切中間載體176，將目的片段切下連接到表達載體pCAMBIA1300上，把目的基因連接到pCAMBIA1300，構建了RNAi干擾載體p1300ERS。
　　 3.SoERS1遺傳轉(zhuǎn)化和原核表達。通過農(nóng)桿菌介導法，把pBIERS轉(zhuǎn)入煙草k346，PC

5、R檢測目的片段與載體GFP基因序列，確認甘蔗SoERS1基因已經(jīng)整合到煙草基因組DNA中，轉(zhuǎn)化效率為61％。對苗期轉(zhuǎn)基因煙草噴施200 mg/L的乙烯利可以提高煙草葉片的乙烯釋放速率。
　　 構建的非融合原核表達載體pETERS1和融合原核表達載體pETERS2在原核菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)均不能表達，這可能與該基因序列中稀有密碼子含量較高，或酶蛋白自身某些特性不適合在原核細胞里表達有關。
　　

6、4.SoERS1啟動子序列克隆和分析。采用基于熱不對稱交錯式PCR原理的染色體步移技術，克隆甘蔗SoERS1基因上游啟動子序列，得到位于翻譯起始密碼子ATG之前的序列1410bp，在GeneBank登錄號為KC862312。該序列與玉米ERS25和玉米ERS14核苷酸同源性分別為82％和80％。利用PlantCARE和PLACE在線預測該啟動子序列，發(fā)現(xiàn)該序列除了含有啟動子基本作用元件CAAT-box和TATA-box之外，還含有多個特