轉(zhuǎn)化體疊加的轉(zhuǎn)基因棉花cry1Ac基因表達及啟動子甲基化分析.pdf

1、轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉是我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，在我國已有20年種植歷史。外源基因表達穩(wěn)定性一直是轉(zhuǎn)基因遺傳分析和分子特征評價的重要內(nèi)容，為了深入研究轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉外源基因表達穩(wěn)定性，本研究以保鈴棉中的MON531轉(zhuǎn)化體(MON531)、7S非功能插入(簡稱7S)，以及與MON531相同載體的MON757轉(zhuǎn)化體(MON757)為研究材料，分析了單個轉(zhuǎn)化體插入和復(fù)合轉(zhuǎn)化體插入在外源殺蟲蛋白表達、mRNA轉(zhuǎn)錄和啟動子甲基化水平上的差異，主要研究結(jié)

2、果如下:
　　1.以棉花基因組與插入序列的連接區(qū)為靶標(biāo)，建立7S的定性、定量PCR檢測方法。利用建立的方法分析了2014年我國湖北省市售的48份轉(zhuǎn)基因棉花種子，有8份檢測到7S非功能插入，定量PCR檢測表明，其含量介于0.46％-34.39％。進一步跟蹤檢測表明，保鈴棉531中7S非功能插入與抗蟲功能性插入在遺傳上不連鎖。
　　2.利用ELISA方法測定MON531、MON757、7S及其復(fù)合轉(zhuǎn)化體Cry1Ac蛋白表達情況。

3、對3個市場棉種材料研究表明，7S非功能插入不影響MON531中Cry1Ac蛋白表達;對具有相同遺傳背景的純合MON531、MON757及其復(fù)合轉(zhuǎn)化體(MON531/MON757)五個階段（親代種子、苗期、蕾期、鈴期、子代種子）Cry1Ac蛋白表達進行跟蹤檢測，表明MON757高于MON531，而MON531/MON757顯著低于兩個單一轉(zhuǎn)化體（除子代種子）。
　　3.通過實時熒光定量PCR分析了MON531、MON757及MON5

4、31/MON757中cry1Ac基因在苗期、蕾期、鈴期的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，mRNA轉(zhuǎn)錄整體呈現(xiàn)先升后降的總趨勢;MON757中cry1Ac基因始終處于較高水平的轉(zhuǎn)錄，與MON531保持大致的兩倍關(guān)系;復(fù)合轉(zhuǎn)化體MON531/MON757中cry1Ac基因劑量在DNA水平上較MON531、MON757增加一倍，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平卻顯著低于單一轉(zhuǎn)化體(p＜0.05)。
　　4.運用亞硫酸鹽測序法(BSP)分析比較MON531、MON

5、757、MON531/MON757全長cry1Ac基因35S啟動子甲基化水平變化。結(jié)果表明，不同生育期的MON531在CG、CHG、CHH及總甲基化率變化差異小，親代為1.0％-1.7％，苗期為4.2％-5.0％，子代為0.8％-1.3％;MON757在CG、CHG區(qū)段的甲基化率約為MON531兩倍，除子代外兩者在CHH區(qū)域及總甲基化水平差異較小;復(fù)合轉(zhuǎn)化體MON531/MON757啟動子功能區(qū)甲基化主要集中于CG、CHG，不同世代甲基

6、化率高達55.0％以上，顯著高于兩個單一轉(zhuǎn)化體;CpG區(qū)域分析表明，不同時期的MON531、MON757目標(biāo)基因啟動子均處于低水平甲基化，但兩者復(fù)合后該區(qū)域呈現(xiàn)顯著的甲基化增高。
　　本研究針對保鈴棉531中7S非功能插入建立特異性定性、定量PCR檢測方法，對市場棉種進行了初測，為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉安全管理提供檢測技術(shù)手段;對同一轉(zhuǎn)化事件的MON531、MON757、7S及其復(fù)合轉(zhuǎn)化體進行目的蛋白檢測，初步探索了不同轉(zhuǎn)化體復(fù)合后的蛋白變