利用EST預(yù)測(cè)蘋果的microRNA并用miR-RACE驗(yàn)證其精確序列.pdf

1、植物miRNA是廣泛分布于植物基因組中的長度在19-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,是真核生物基因表達(dá)的一類負(fù)調(diào)控因子,主要通過指導(dǎo)靶基因的切割或降低靶基因的翻譯從轉(zhuǎn)錄后水平上抑制植物基因表達(dá),在控制植物的發(fā)育、開花時(shí)序、新陳代謝、應(yīng)激反應(yīng)等方面起著重要作用。miRNA的保守性特點(diǎn)為基因組信息不完全的非模式植物提供了良好的基礎(chǔ)。目前,有關(guān)miRNA的報(bào)道很多,果樹上也有相關(guān)的報(bào)道,但在蘋果上還未有關(guān)于miRNA精確序列確定及其miRN

2、A和靶基因表達(dá)特性的報(bào)道。
　　 蘋果是世界性的重要的經(jīng)濟(jì)水果之一。除了它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,大量有效的ESTs信息,使之成為基因表達(dá)研究的極好的實(shí)驗(yàn)材料。
　　 本論文以蘋果為實(shí)驗(yàn)材料,通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了蘋果中的miRNA及其靶基因,并用qRT-PCR研究了蘋果中miRNA及其靶基因的表達(dá)。使用了miR-RACE方法鑒定生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miRNA的精確序列。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA的方

3、法。從NCBI數(shù)據(jù)庫中蘋果的32,4000個(gè)EST中挖掘miRNAs。通過采取一系列的篩選條件,我們從蘋果的EST序列中找到了31個(gè)潛在的miRNA,這些潛在的miRNA屬于16個(gè)基因家族分別是:mdo-miR156,mdo-miR162,mdo-miR167,mdo-miR172,mdo-miR393,mdo-miR394,mdo-miR398,mdo-miR477,mdo-miR482,mdo-miR828,mdo-miR845,m

4、do-miR1535,mdo-miR1888,mdo-miR1046,mdo-miR2101.
　　 2.本研究中,我們報(bào)告一個(gè)有效的方法來確定生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miRNA精確序列。這個(gè)方法主要包括小RNA文庫的構(gòu)建,miRNA的5'RACE和3'RACE,RACE產(chǎn)物的克隆測(cè)序.我們的方法的核心步驟,是兩個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增miRNA的5'RACE和3'RACE以及特異引物的設(shè)計(jì)。通過這種方法我們確定了16個(gè)mdo-miRNA的精確

5、序列。我們驗(yàn)證和預(yù)測(cè)的序列也不是100％相同的,與預(yù)測(cè)的相比主要是mdo-miR1535的最后兩個(gè)堿基有差異。
　　 3.通過使用潛在的miRNA序列,進(jìn)一步使用NCBI中mRNA數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索,預(yù)測(cè)到12個(gè)mdo-miRNA的靶基因,并對(duì)這些靶基因進(jìn)行了功能分析,發(fā)現(xiàn)這些靶基因在蘋果的生長和發(fā)育過程中起著重要的作用。
　　 4.為了進(jìn)一步研究蘋果在整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期miRNA及其靶基因的表達(dá)特性,我們從蘋果的不同

6、發(fā)育時(shí)期的莖、葉(幼葉和老葉)、花(花芽和花蕾)、果(直徑分別為1.5cm和4cm的小果和大果)等不同器官構(gòu)建了小RNA的cDNA文庫,利用熒光定量PCR研究精確序列的表達(dá)。同時(shí)也構(gòu)建了總RNA的cDNA文庫,研究了預(yù)測(cè)的靶基因的表達(dá)。結(jié)果表明:一些蘋果的miRNAs是在所有檢測(cè)的組織器官中都是表達(dá)的,一些miRNA表現(xiàn)出器官、物種或不同生長發(fā)育時(shí)期的特異性表達(dá)。Mdo-miRNAs和其靶基因在蘋果不同發(fā)育時(shí)期的不同器官中存在著相互消長