蘋果EST-SSR引物的開發(fā)及部分品種親緣關(guān)系分析.pdf

1、蘋果屬（MalusMill.）植物分布廣泛，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源極為豐富。蘋果屬植物基因型高度雜合，種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系和演化過程等許多理論問題利用傳統(tǒng)的分析方法難以解決。開發(fā)適用于蘋果的EST-SSR標(biāo)記對(duì)于研究蘋果屬種質(zhì)資源的起源演化、親緣關(guān)系以及遺傳多樣性等具有重要意義。本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蘋果EST的SSR位點(diǎn)，開發(fā)了35對(duì)EST-SSR引物，建立了蘋果EST-SSR體系，并利用篩選出的16對(duì)引物對(duì)118份蘋果資源的親緣關(guān)

2、系進(jìn)行了研究。研究結(jié)果如下： 1.利用SSRIT軟件，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的86228條單一蘋果屬EST序列中查找出13259條含SSR的EST，其中有8217條符合可利用性篩選條件。在所有可用的EST-SSR序列中，以二核苷酸為重復(fù)單元的序列最多，為4421條，在二核苷酸重復(fù)類型中又以CT/TC形式的SSR最為豐富，其次為AG/GA。 2.從篩選出的8217條可利用的EST-SSR序列中隨機(jī)選取部分序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則

3、，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)出35對(duì)EST-SSR引物。 3.通過對(duì)蘋果EST-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確立了最佳體系。即在25μL體系中，MgCl2濃度為2.0mmol·L-1，dNTPs濃度為0.3mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量為1.0U，DNA模板用量為30ng，引物濃度為0.4μmol·L-1。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循

4、環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。該體系穩(wěn)定可靠，適用于蘋果SSR分析。 4.利用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)35對(duì)引物進(jìn)行篩選，以條帶的多態(tài)性和穩(wěn)定性為標(biāo)準(zhǔn)篩選出16對(duì)多態(tài)性較好的引物。利用這16對(duì)引物對(duì)118份蘋果品種基因組DNA擴(kuò)增，共擴(kuò)增出等位基因位點(diǎn)138個(gè)，位點(diǎn)數(shù)的變化從3到13不等，平均每對(duì)引物檢測(cè)到8.62個(gè)位點(diǎn)，總的多態(tài)性比率為94.2％，各引物的多態(tài)性比例分布于81.8％～100.0％。 5.根據(jù)ES

5、T-SSR譜帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，應(yīng)用NTSYS-pc2.0e軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算，118份蘋果品種的相似系數(shù)的變化范圍在0.48～1.00之間，說明供試蘋果種質(zhì)資源間的遺傳變異比較大，遺傳多樣性較高。利用UPGMA法構(gòu)建聚類樹狀圖，在相似性系數(shù)0.65處可將118個(gè)供試材料分為五大組：其中第一組又可分為兩個(gè)亞組，包含了絕大部分供試材料；第二、三、四和五組包含的品種數(shù)目分別為12個(gè)、11個(gè)、3個(gè)和2個(gè)；第五組與其它組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性系