桃EST-SSR引物開發(fā)及其在部分薔薇科物種中的通用性研究.pdf

1、桃是世界上重要的經濟果樹和園林樹種，同時也是薔薇科木本模式植物，研究桃的種質資源和遺傳背景具有重大意義。在當前，SSR標記仍然是研究植物物種種質資源和遺傳背景的重要手段之一。然而，桃的可用SSR引物數(shù)量稀少，薔薇科其他物種的SSR引物數(shù)量更是寥寥無幾。2013年，Verde等人基于桃的不同器官進行了轉錄組測序，匯總先前的研究后共提交到NCBI公共數(shù)據(jù)庫有80797條無冗余ESTs序列，為桃EST-SSR引物的大規(guī)模開發(fā)提供了豐富的序列資

2、源。本研究先利用MISA軟件對來自NCBI數(shù)據(jù)庫的80797條EST序列進行SSR位點挖掘，然后利用primer3模塊批量設計SSR引物，最后，采用PCR技術在12個不同類型的桃品種上分組隨機驗證了100對二核苷酸重復引物，在30個常見薔薇科物種上分組隨機調查了48對桃EST-SSR引物的通用性。主要研究結論如下:
　　(1)EST-SSR位點挖掘
　　利用CD hit軟件對80797條無冗余EST序列的冗余率進行復查，發(fā)現(xiàn)

3、冗余率仍有12.3％。用MISA軟件對剩余70360條EST序列進行SSR位點挖掘，發(fā)現(xiàn)有12519個SSR位點分布于10272條ESTs序列中，SSR位點出現(xiàn)頻率為14.60％。SSR類型覆蓋二核苷酸重復到六核苷酸重復的159種基序類型。其中，以單核苷酸重復、二核苷酸重復和三核苷酸重復類型最多，分別占35.80％、36.43％和25.56％。此外，SSR基序重復次數(shù)越多，SSR位點分布頻率越低。在基序長度相同的SSRs中，不同基序組成

4、分布不均勻，并且對少數(shù)基序組成有偏好。
　　(2)SSR引物設計
　　利用primer3模塊對12519條EST-SSR設計引物，得到4526對SSR引物，其中，常用的二核苷酸引物和三核苷酸引物合計有2598對。引物開發(fā)效率只取決于EST-SSR基數(shù)的大小，引物開發(fā)總效率為36.15％。
　　(3)SSR-PCR驗證
　　分段抽選的100對SSR引物在12個不同類型的桃品種上擴增出237個條帶，平均2.37個;7

5、9％的引物能夠擴增出2個或2個以上的條帶。期望雜合度變幅為0-0.7659，平均0.3817;觀察雜合度變幅為0-0.9167，平均0.1230;引物鑒別力變幅為0-0.8056，平均0.4054。
　　(4)通用性研究
　　通用性分析表明:66.67％的SSR引物能夠在30個薔薇科物種上全部有效擴增，33.33％的SSR引物能夠在30個薔薇科物種中部分有效擴增。其中，引物018在16個物種上有缺失，是缺失率最高的引物;物種