煙草EST-SSR標(biāo)記的建立及其應(yīng)用.pdf

1、煙草(Nicotiana tabacum)為茄科(Solanaceae)煙屬(Nicotiana)一年或多年生作物，被認(rèn)為起源南美洲，現(xiàn)已成為一種世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物，是最早應(yīng)用于分子生物和基因工程研究的模式植物之一。我國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)國(guó)，但煙草育種面臨親本匱乏、品種遺傳背景狹窄、盲目性、重復(fù)性大等問(wèn)題。近年來(lái)分子標(biāo)記等分子生物技術(shù)在煙草領(lǐng)域應(yīng)用中的研究，取得了一定進(jìn)展。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是90年代興起的一種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星在染

2、色體上分布均勻，數(shù)量也多，具有高度的變異，多態(tài)性信息非常豐富等優(yōu)點(diǎn)被迅速且廣泛地運(yùn)用于生命科學(xué)的各領(lǐng)域中。利用現(xiàn)有生物數(shù)據(jù)庫(kù)中的煙草EST資源，在了解煙草EST中SSR的信息的基礎(chǔ)上，首次建立了EST-SSR標(biāo)記，同時(shí)對(duì)其在品種資源分析中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。主要研究結(jié)果如下： 1、明確了煙草EST中SSR的頻率及特性。利用生物信息學(xué)方法在含有40666條煙草EST序列的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記篩選，共發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列3685個(gè)，占整個(gè)

3、EST數(shù)據(jù)庫(kù)的9.062％。其中雙堿基重復(fù)序列2614個(gè)、三堿基序列1019個(gè)，分別占在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列的70.936％和27.652％。煙草EST-SSR中，二核苷酸重復(fù)是主要的重復(fù)類型，出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是AG/CT重復(fù)。煙草EST中SSR信息的明確為進(jìn)一步建立和應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。 2、建立了煙草EST-SSR標(biāo)記。以烤煙品種K326為材料，研究了煙草EST-SSR分析中PCR反應(yīng)體系的主要成分對(duì)

4、SSR擴(kuò)增結(jié)果的影響。結(jié)果表明：在總體積為20μL的PCR反應(yīng)中，含25ng模板DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，MgCl<,2>終濃度為1.5mmol·L<'-1>，dNTPs濃度為200μmol·L<'-1>，引物濃度為0.05μmol·L<'-1>時(shí)效果較好。根據(jù)篩選到的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)并合成引物50對(duì)，其中30對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，23對(duì)產(chǎn)物條帶比較清晰。 3、本文應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記，對(duì)煙草屬2個(gè)種6份材料的遺傳多樣

5、性進(jìn)行了分析。從50對(duì)SSR引物中共篩選出15個(gè)多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，6個(gè)樣品IDNA共擴(kuò)增出91條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.06條譜帶，多態(tài)性條帶比率達(dá)51.04％。種間遺傳相似系數(shù)在0.2681～0.9411之間，平均為0.6046，表現(xiàn)出豐富的遺傳多態(tài)性。紅花種的4個(gè)栽培品種之間的遺傳相似系數(shù)較高，在0.5277～0.9411之間，其中來(lái)自美國(guó)的G80和革新五號(hào)遺傳相似系數(shù)最高，為0.9411，揭示了煙草栽培種內(nèi)