乳頭溢液及血液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA篩選驗證及其功能預(yù)測的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，其早期診斷是重要的臨床課題。MicroRNA(miRNA)是一種小的、非編碼單鏈RNA，它在生物體內(nèi)基本的生理過程、病理過程中發(fā)揮了重要的作用。很多研究結(jié)果證明，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可以作為惡性腫瘤的生物標(biāo)記物。miRNA被證明存在于多種體液中并保持相對穩(wěn)定，這為其成為腫瘤標(biāo)記物提供了先決條件。目前關(guān)于乳腺癌患者的乳頭溢液及血液中miRNA作為腫瘤標(biāo)記物的領(lǐng)域尚需探索。
　　第一部

2、分乳頭溢液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA的篩選、驗證與功能預(yù)測
　　目的:
　　1.證實乳頭溢液中的miRNA的存在。
　　2.篩選并驗證乳腺癌與乳腺良性腫瘤乳頭溢液中miRNA的差異表達(dá)。
　　3.驗證生理性乳頭溢液——乳汁中miRNA的存在及其穩(wěn)定性。
　　4.運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析差異表達(dá)的miRNA的潛在作用機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.收集3例乳腺癌患者、3例乳腺良性腫瘤患者的乳頭溢

3、液，通過miRNA芯片篩選差異表達(dá)miRNA。
　　2.在8例乳腺癌患者、13例乳腺良性腫瘤患者的乳頭溢液中，通過實時定量PCR驗證差異表達(dá)的miRNA。
　　3.2例產(chǎn)婦乳汁于4℃放置0-72小時，使用實時定量PCR檢測miRNA表達(dá)水平隨時間的變化。
　　4.使用Targetscan及miRDB軟件預(yù)測miRNA的靶基因，然后進(jìn)行GO分析、KEGGpathway富集、蛋白互作分析。
　　結(jié)果:
　　1.

4、芯片結(jié)果提示:相比于乳腺良性腫瘤的乳頭溢液，3個miRNA(miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646)在乳腺癌的乳頭溢液中表達(dá)上調(diào)，3個miRNA（miR-4732-5p、miR-4687-3p、miR-S1-5p）表達(dá)下調(diào)。
　　2.經(jīng)過實時定量PCR驗證，證實在乳腺癌的乳頭溢液中，miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646表達(dá)上調(diào)，而miR-4732-5p表達(dá)下調(diào)。
　　3.乳汁在置

5、于4℃的72小時內(nèi)，其miR-3646、miR-4732-5p的表達(dá)水平相對穩(wěn)定。
　　4.許多腫瘤相關(guān)基因如ADIPOQ、CPEB1、DNAJB4、EIF4E、APP及BCLAF1等是miR-4484、miR-3646、miR-4732-5p的潛在靶基因。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-3646的潛在靶基因與Rap1、TGF-β通路相關(guān)，miR-4484的潛在靶基因可能參與ErbB通路、雌激素通路、點(diǎn)狀粘附通路，而miR-4732-5

6、p的潛在靶基因可富集到癌癥蛋白聚糖通路。蛋白互作分析提示，這些miRNA的潛在靶基因存在相互作用的可能。轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)，這些潛在靶基因受到ATF、CREB、C/EBPalpha、c-fos、c-Jun等重要腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論:
　　在乳腺癌患者的乳頭溢液中證實miR-4484、miR-K12-5-5p及miR-3646的表達(dá)上調(diào)，miR-4732-5p的表達(dá)下調(diào)。miR-3646、miR-473

7、2-5p在乳汁中表達(dá)穩(wěn)定性較好。生物信息學(xué)分析表明，miRNA可能通過調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白參與多個癌癥相關(guān)通路。本研究為miRNA成為乳頭溢液中乳腺癌腫瘤標(biāo)記物提供了理論基礎(chǔ)。
　　第二部分血液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA的篩選、驗證與功能預(yù)測
　　目的:
　　1.篩選并驗證乳腺癌患者與健康對照者全血中差異表達(dá)的miRNA。
　　2.運(yùn)用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的miRNA可能的作用機(jī)制及預(yù)后價值。
　　材料與方

8、法:
　　1.收集6例乳腺癌患者、6例健康對照的全血樣品，通過miRNA芯片篩選差異表達(dá)miRNA。
　　2.在15例乳腺癌患者、13例健康對照的全血樣品中，通過實時定量PCR驗證差異表達(dá)的miRNA。
　　3.miRWalk數(shù)據(jù)庫用于預(yù)測miRNA靶基因，并使用DAVID工具尋找潛在靶基因顯著富集的通路。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析miRNA及其潛在靶基因在乳腺癌中的預(yù)后價值。
　　結(jié)果:
　　1.通過miRNA芯

9、片共發(fā)現(xiàn)171個差異表達(dá)的miRNA，乳腺癌組與健康對照組相比有169個上調(diào)，2個下調(diào)。
　　2.通過實時定量PCR證實了5個miRNA(miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-374b-5p和miR-942-5p)在乳腺癌中上調(diào)。ROC曲線分析提示，這5個miRNA的表達(dá)可較好地區(qū)分乳腺癌患者及健康對照者。
　　3.miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-37

10、4b-5p和miR-942-5p在早期乳腺癌患者全血中就已發(fā)生上調(diào)。
　　4.共有855個基因被預(yù)測為5個miRNA的靶基因，其中ONECUT2是5個miRNA的共同潛在靶基因。公開數(shù)據(jù)的分析顯示，這些miRNA和潛在靶基因與乳腺癌患者的生存相關(guān)。此外，這5個miRNA的潛在靶基因在許多癌癥相關(guān)通路中顯著富集，包括“MicroRNAsincancer”通路，“Pathwaysincancer”通路，F(xiàn)oxO信號通路，Ras信號通路