肝纖維化相關(guān)microRNA的篩選及其功能研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞。目前研究認(rèn)為靜息型HSC激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨虷SC，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此，肝星狀細(xì)胞活化機(jī)制是目前肝纖維化防治的一個研究熱點。microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。microRNA通過堿基互補

2、配對的方式識別靶基因mRNA，并根據(jù)互補程度的不同降解靶基因mRNA或者阻遏靶基因mRNA的翻譯。microRNA參與多種生物調(diào)節(jié)途徑，包括器官發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。目前國內(nèi)外關(guān)于microRNA在肝星狀細(xì)胞活化過程中調(diào)節(jié)作用的報道還很少。因此，本論文研究目的旨在研究microRNA在肝星狀細(xì)胞活化過程中的調(diào)節(jié)作用，以深入闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制中microRNA的重要性，也為肝纖維化的早期干預(yù)提

3、供新的思路。
　　 本研究通過分離大鼠原代肝星狀細(xì)胞和構(gòu)建DMN大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用高通量microRNA芯片技術(shù)，對肝星狀細(xì)胞活化過程(靜息狀態(tài)－半活化狀態(tài)－完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期)進(jìn)行microRNA譜檢測，篩選并驗證與肝纖維化相關(guān)的microRNA；miR－335證實在肝星狀細(xì)胞活化過程中顯著降低，通過構(gòu)建miR－335過表達(dá)慢病毒載體，研究miR－335對肝星狀細(xì)胞增殖、活化

4、與遷移功能的影響，并探討其可能的機(jī)制。研究共分三個部分：(1)大鼠肝星狀細(xì)胞的分離鑒定與培養(yǎng)；(2)肝星狀細(xì)胞活化過程(靜息狀態(tài)－半活化狀態(tài)-完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期)microRNA芯片譜其生物信息學(xué)分析；(3)miR－335過表達(dá)慢病毒載體抑制肝星狀細(xì)胞活化與遷移及其相關(guān)機(jī)制研究。
　　 方法：
　　 一、HSC的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 雄性Sprague-Darwle

5、y大鼠(400g-600g)，分離門靜脈并插管，采用酶消化－密度梯度離心法，依次灌注鏈酶蛋白酶－膠原酶，37℃原位消化，12％Nycodenz密度梯度離心獲得HSC，含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。328nm紫外光下觀察HSC自發(fā)熒光，細(xì)胞免疫熒光檢測細(xì)胞Desmin與α-SMA表達(dá)，real-timePCR檢測細(xì)胞TypeⅠcollagen與α-SMA表達(dá)，鑒定HSC純度。
　　 二、肝星狀細(xì)胞活化

6、過程(靜息狀態(tài)－半活化狀態(tài)－完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0－S4期)microRNA芯片譜及其生物信息學(xué)分析
　　 (一)肝星狀細(xì)胞活化各期microRNA芯片譜及生物信息學(xué)分析
　　 HSC活化各期microRNA芯片檢測：肝星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)2天(d2)作為靜息狀態(tài)HSC；培養(yǎng)7天(d7)作為半活化狀態(tài)狀態(tài)HSC；培養(yǎng)14天(d14)作為完全活化狀態(tài)HSC。
　　 差異microRN

7、A生物信息學(xué)分析：Geneontology(GO)分析--應(yīng)用GO分析軟件對差異microRNA進(jìn)行功能分析，得到可能的富集功能，尋找差異microRNA可能與哪些基因功能改變相關(guān)：pathway分析--基于KEGG等數(shù)據(jù)庫，得到顯著富集的生物信號通路或者代謝通路，尋找差異microRNA可能與哪些細(xì)胞通路改變相關(guān)。
　　 (二)DMN肝纖維化動物模型構(gòu)建、各期肝纖維化組織microRNA芯片譜及生物信息學(xué)分析
　　 D

8、MN肝纖維化動物模型構(gòu)建及肝纖維化各期肝組織microRNA芯片檢測：1％DMN(10ug/kg)每周連續(xù)三天腹腔注射，連續(xù)四周。每周處死一批大鼠，進(jìn)行肝組織病理檢測及肝功能檢測。
　　 差異microRNA生物信息學(xué)分析：Geneontology(GO)分析、pathway分析和microRNA-gene-network。
　　 三、miR-335過表達(dá)慢病毒載體抑制肝星狀細(xì)胞活化與遷移及其相關(guān)機(jī)制研究
　　

9、(一)miR－335過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及驗證
　　 miR-335過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建：將miR－335前體結(jié)構(gòu)插入pLV-CMV-MCS-GFP－FLAGmiRNA表達(dá)載體(pLV-miR－335)，然后進(jìn)行病毒質(zhì)粒的包裝、擴(kuò)增與濃縮，最后形成有效的miR－335過表達(dá)慢病毒載體；
　　 miR－335過表達(dá)慢病毒載體有效性驗證：以不同MOI值(MOI取5到50)將miR－335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC，應(yīng)用熒

10、光顯微鏡評估其轉(zhuǎn)染效率，然后應(yīng)用real－timePCR的方法檢測轉(zhuǎn)染前后miR－335表達(dá)水平變化。
　　 (二)HSC增殖的檢測
　　 在96孔培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106cells/ml密度種植原代HSC，無血清DMEM同步化24小時，miR－335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞3-4天后，應(yīng)用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞增殖率。
　　 (三)HSC細(xì)胞遷移的檢測
　　 1、劃痕實驗：在6孔培養(yǎng)皿內(nèi)按l×105cel

11、ls/ml密度種植HSC，無血清培養(yǎng)基同步化24小時，miR-335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞3-4天后，用Tip(100ul)尖端同一方向垂直劃痕，分別在12h和36h后顯微鏡下拍照，計算細(xì)胞遷移率=(作用前劃痕內(nèi)面垂直距離-作用后劃痕內(nèi)面垂直距離)/作用前劃痕內(nèi)面垂直距離×100％。
　　 2、Transwell：在24孔板Transwell小窄中按1×104cells/well密度種植HSC，無血清DMEM同步化24小時，m

12、iR-335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞3-4天后，用500ul含20％FBS的培養(yǎng)基趨化HSC24小時，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計算遷移細(xì)胞數(shù)目。
　　 (四)HSC活化的檢測
　　 1、應(yīng)用real-timePCR的方法檢測肝星狀細(xì)胞TypeⅠcollagen與α-SMAmRNA水平的表達(dá)；
　　 2、應(yīng)用WesternBlot的方法檢測肝星狀細(xì)胞TypeⅠcollagen與α-SMA蛋白水平的表達(dá)

13、。
　　 四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)由SPSS16.0軟件統(tǒng)計包處理。多組間的比較用One-WayANOVA方差分析。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 一、原代大鼠HSC的分離與鑒定
　　 1、328nm紫外光下自發(fā)熒光及Desmin、α-SMA細(xì)胞免疫熒光檢測靜息與活化HSC細(xì)胞純度達(dá)95％以上，能滿足實驗需要。
　　 2、應(yīng)用real－timeP

14、CR檢測體外培養(yǎng)2天、7天以及14天的HSC活化標(biāo)志物TypeⅠcollagen與α-SMAmRNA的表達(dá)。與2天相比，TypeⅠcollagen與α-SMAmRNA在7天時輕度升高，在14天時顯著增加，因此，將HSC2d作為靜息狀態(tài)HSC，7d作為半活化狀態(tài)HSC，14d作為完全活化狀態(tài)HSC。
　　 二、DMN肝纖維化動物模型構(gòu)建
　　 隨著DMN給藥時間的延長，肝功能逐漸降低，肝纖維化程度逐漸加重，至第四周給藥后，

15、已能觀察到明顯的肝硬化甚至伴有失代償癥狀(出現(xiàn)腹水)。根據(jù)肝組織病理結(jié)果，DMN給藥第一周作為肝纖維化S1期，給藥第二周作為肝纖維化S2期，給藥第三周作為肝纖維化S3期，給藥第四周作為肝纖維化S4期。
　　 三、肝星狀細(xì)胞活化各期microRNA芯片譜及生物信息學(xué)分析
　　 1、17個microRNA(miR－345-5p、miR-152、miR－199a－5p、miR－218、miR－125b－5p、miR－214，m

16、iR－34c，miR－34b，miR－199a－3p，miR-425，miR－221，miR－301a，miR－222、miR－193、miR－31、miR－143、miR－145)在肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)逐漸升高；14個microRNA(miR-101a、miR－335、miR－877、miR－139－5p、miR－150、miR-126*、miR－192、miR-450a、rno-miR-497、rno-miR-338、rno-m

17、iR-10a-5p、rno-miR-378*、rno-miR-195、miR-126)在肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)逐漸降低。
　　 2、生物信息學(xué)分析：
　　 (1)GO分析：28個GOs被肝星狀細(xì)胞活化過程中上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)，31個GOs被肝星狀細(xì)胞活化過程中下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)；
　　 (2)GO－Map分析：GO－Map顯示最主要的GOs為神經(jīng)元分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡介導(dǎo)的運輸、細(xì)胞處理、細(xì)胞分

18、化、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化以及細(xì)胞遷移；
　　 (3)pathway分析：
　　 Phosphatidylinositolsignalingsystem、Wntsignalingpathway、mTORsignalingpathway、Focaladhesion、ECM－receptorinteraction，Notchsignalingpathway，Tcellrecep

19、torsignalingpathway、TGF-betasignalingpathway、Regulationofactincytoskeleton、Insulinsignalingpathway、MAPKsignalingpathway、VEGFsignalingpathway、Hedgehogsignalingpathway等可能被肝星狀細(xì)胞活化過程中上調(diào)的microRNA所調(diào)節(jié)；
　　 TGF-betasignalingp

20、athway、mTORsignalingpathway、Wntsignalingpathway、Adherensjunction、Non-smallcelllungcancer、Pancreaticcancer、Bladdercancer、Phosphatidylinositolsignalingsystem、Prostatecancer、Glioma、SNAREinteractionsinvesiculartransport、O-Gl

21、ycanbiosynthesis、Hedgehogsignalingpathway、Focaladhesion、VEGFsignalingpathway、MAPKsignalingpathway、Insulinsignalingpathway等可能被肝星狀細(xì)胞活化過程中下調(diào)的microRNA所調(diào)節(jié)。
　　 四、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(SO-S4期)microRNA芯片譜及其生物信息學(xué)分析
　　 1、10個m

22、icroRNA(miR－34b、miR－34c、miR－34a、miR－221、miR－146b、miR－214、miR-199a－5p、miR-199a－3p、miR－223、miR-324-5p)在肝纖維化過程中表達(dá)逐漸升高；5個microRNA(miR－878、miR－193、miR－378、miR－92a、miR－19a)在肝纖維化過程中表達(dá)逐漸降低。
　　 2、生物信息學(xué)分析(GO分析和pathway分析)：
　

23、　 (1)GO分析：15個GOs被肝纖維化過程中表達(dá)上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)，10個GOs被肝纖維化過程中表達(dá)下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)。
　　 (2)pathway分析：
　　 Glycerophospholipidmetabolism、Pyruvatemetabolism、Lysinedegradation、Proceasome、Reductivecarboxylatecycle(CO2fixation)、Ben

24、zoatedegradationviaCoAligation、Riboflavinmetabolism、Focaladhesion、PPARsignalingpathway、MAPKsignalingpathway、mTORsignalingpathway等可能被肝纖維化過程中表達(dá)上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)；Butanoatemetabolism、Arginineandprolinemetabolism、Cellcycle、Glioma

25、、Insulinsignalingpathway、MAPKsignalingpathway、Focaladhesion、Regulationofactincytoskeleton、ECM-receptorinteraction、Fattyacidmetabolism、TGF-betasignalingpathway等可能被肝纖維化過程中表達(dá)下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)。
　　 (3)microRNA-gene-network分析：

26、得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的microRNA以及被調(diào)控最多的靶基因。
　　 五、miR-335過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及驗證
　　 1、應(yīng)用real-timePCR技術(shù)證實，miR-335、miR-150的表達(dá)在HSC活化過程中顯著下調(diào)，miR-221、miR-143、miR-145的表達(dá)在HSC活化過程中顯著上調(diào)，與芯片檢測結(jié)果符合。
　　 2、選取miR-335進(jìn)行功能研究，構(gòu)建miR-335過表達(dá)慢病毒載體，MOI值為50

27、時，miR-335過表達(dá)慢病毒載體HSC轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上，real-timePCR檢測miR-335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC后miR-335的表達(dá)量增加175倍，恢復(fù)到靜息狀態(tài)HSC水平，證實miR-335過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功。
　　 六、miR-335過表達(dá)慢病毒載體對HSC活化的影響
　　 miR-335過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC后明顯抑制HSC活化標(biāo)志物TypeⅠcollagen與α-SMAmRNA和蛋白

28、的表達(dá)(P<0.05)。real-timePCR和Westernblot結(jié)果顯示，α-SMAmRNA和蛋白的表達(dá)被miR-335過表達(dá)分別抑制了70％和31％；TypeⅠcollagenmRNA和蛋白表達(dá)分別被抑制了53％和20％。
　　 七、miR-335過表達(dá)慢病毒載體對HSC遷移的影響
　　 1、Transwell結(jié)果顯示，miR-335過表達(dá)抑制HSC遷移的40％(P<0.05)；
　　 2、細(xì)胞劃痕實驗

29、結(jié)果顯示，miR-335過表達(dá)抑制HSC遷移的45％(P<0.05)。
　　 八、miR-335過表達(dá)慢病毒載體對HSC增殖的影響
　　 正常組、陰性對照組、miR-335過表達(dá)組三組細(xì)胞應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率，連續(xù)監(jiān)測5天，三組細(xì)胞增殖率之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 九、miR-335過表達(dá)慢病毒載體對TNC表達(dá)的影響
　　 1、TNCmRNA和蛋白的表達(dá)量在HSC活化過程中顯著升高；
　　

30、 2、miR-335過表達(dá)顯著降低TNCmRNA和蛋白的表達(dá)量。real－timePCR和Westernblot結(jié)果顯示，TNCmRNA和蛋白的表達(dá)量分別被抑制了76％和74％。
　　 十、TNC對HSC遷移功能的影響
　　 給予外源性TNC(20ug/ml；CC115；Chemicon)，HSC增值率未見明顯改變，但HSC遷移率提高50％。
　　 結(jié)論
　　 一、在肝星狀細(xì)胞活化過程中，17個micro

31、RNA在肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)逐漸升高，14個microRNA在肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)逐漸降低；在肝纖維化進(jìn)展中，10個microRNA在肝纖維化過程中表達(dá)逐漸升高；5個microRNA在肝纖維化過程中表達(dá)逐漸降低。生物信息學(xué)分析顯示，多個和肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)的基因功能以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如細(xì)胞遷移、TGF－betasignalingpathway、VEGFsignalingpathway等等均受到這些肝纖維化相關(guān)microRNA