利用cDNA-EST序列大規(guī)模開發(fā)內(nèi)含子多態(tài)性標(biāo)記的研究.pdf

1、隨著大規(guī)模植物功能基因組測序項目的進(jìn)展，產(chǎn)生了大量的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列。內(nèi)含子廣泛分布于真核生物基因組中，其變異程度通常比編碼序列高得多。利用內(nèi)含子上的多態(tài)性，包括內(nèi)含子長度多態(tài)性(ILP)和內(nèi)含子單核苷酸多態(tài)性(ISNP)，可開發(fā)成分子標(biāo)記，稱為內(nèi)含子多態(tài)性(IP)標(biāo)記。內(nèi)含子在基因中的位置在物種間相對保守，因此通過將某個植物的EST序列與模式植物水稻或擬南芥的同源基因進(jìn)行比較，可以推斷該植物EST上的內(nèi)含子位置(即相鄰?fù)怙@子

2、之間的連接點)。在所推測的內(nèi)含子位置兩側(cè)的EST序列上設(shè)計一對引物，就能夠在該植物的基因組中擴(kuò)增出包含所預(yù)測的內(nèi)含子的片段并檢測到該內(nèi)含子中存在的多態(tài)性，從而開發(fā)出IP標(biāo)記。也就是說，這樣的引物具有開發(fā)出IP標(biāo)記的潛力，因此我們稱之為潛在的內(nèi)含子多態(tài)性(PIP)標(biāo)記。基于上述原理，本研究進(jìn)行了大規(guī)模的PIP標(biāo)記開發(fā)，構(gòu)建了PIP數(shù)據(jù)庫，并在棉花中進(jìn)行了ILP標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用，同時對ISNP的檢測方法進(jìn)行了探討。主要結(jié)果如下： 1

3、、在59個物種中開發(fā)了57,658個PIP標(biāo)記。 2、建立了一個基于互聯(lián)網(wǎng)的PIP標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(http://ibi.zju.edu.cn/pgl/pip)。該數(shù)據(jù)庫提供以下功能：1)介紹PIP標(biāo)記開發(fā)的流程和方法；2)查詢或下載PIP標(biāo)記；3)對用戶提交的cDNA/EST序列進(jìn)行PIP引物的在線設(shè)計；4)比較不同物種間的PIP標(biāo)記的同源性。 3、對PIP標(biāo)記的電子PCR分析表明，根據(jù)模式植物擬南芥對苜蓿及白楊內(nèi)含子的預(yù)測

4、的準(zhǔn)確率分別達(dá)到99.40％和98.71％，說明內(nèi)含子位置確實非常保守。 4、對模式植物基于自身開發(fā)的PIP標(biāo)記的比較分析顯示，水稻兩個亞種(粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11)之間及擬南芥兩個生態(tài)型(Columbia和Landsberg)之間ILP頻率分別為17.98％和18.61％，ISNP頻率分別為51.22％和53.18％，說明植物中內(nèi)含子多態(tài)性水平是非常高的，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。 5、合成了220對棉花PI

5、P標(biāo)記引物，對19個栽培棉和25個野生棉材料進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)92.27％的引物能得到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物，65.02％獲得單一條帶，94.09％的擴(kuò)增產(chǎn)物包含內(nèi)含子。在栽培棉(包括陸地棉和海島棉)中ILP頻率僅為3.18％，但野生棉中達(dá)到47.78％，ILP標(biāo)記的PIC值變化在0.061-0.721之間，平均為0.34。 6、用開發(fā)的棉花ILP標(biāo)記對25個野生棉種進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)ILP標(biāo)記能嚴(yán)格區(qū)分出A、B、C、D、E、F和G七