尿酸酶的聚乙二醇修飾及其成藥性的初步評(píng)價(jià).pdf

1、大腸桿菌重組表達(dá)苛求芽孢桿菌(ATCC29604)尿酸酶,為同源四聚體,序列中每條多肽鏈含有17個(gè)氨基,經(jīng)兩次DEAE-cellulose柱純化后比活性達(dá)到6.0 IU/mg。在大鼠體內(nèi)的代謝半衰期只有10-15min,并顯示出較強(qiáng)的免疫原性。聚乙二醇修飾是提高蛋白質(zhì)成藥性的主要手段。本文優(yōu)化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)修飾此重組表達(dá)尿酸酶的條件,并初步評(píng)價(jià)mPEG修飾尿酸酶的成藥性。
　　 1聚乙二醇修飾試劑的制備
　　

2、 結(jié)合尿酸酶蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),用兩類方法制備了數(shù)種主要以尿酸酶蛋白表面的游離氨基作為修飾目標(biāo)的修飾試劑。一類方法用單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5k)和350(mPEG350)先與丁二酸酐在四氫呋喃中反應(yīng),生成聚乙二醇丁二酸單酯后再與N-羥基琥珀酰亞胺經(jīng)DCC脫水,制得單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯(SS-mPEG5k,SS-mPEG350),其中SS-mPEG5k收率為60-75％,SS-mPEG350收率約56%。另一類方法

3、用mPEG5k先與三氯甲基碳酸酯在二氯甲烷中反應(yīng)生成單甲氧基聚乙二醇碳酰氯,再與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)得琥珀酰亞胺的單甲氧基聚乙二醇碳酸酯(SC-mPEG5k),收率約87%。為比較不同體積N-羥基琥珀酰亞胺酯修飾氨基的差異,同時(shí)用乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺在DCC作用下制得其乙酸酯(Ac-NHS),收率約90%。通過與萘替乙二胺衍生檢測(cè)活化酯同氨基的反應(yīng)活性并估算其含量。
　　 2聚乙二醇修飾尿酸酶的條件優(yōu)化
　　 TN

4、BS測(cè)定氨基,考察聚乙二醇修飾劑與尿酸酶多肽鏈的數(shù)量(摩爾比)、尿酸酶氨基的修飾度等對(duì)修飾尿酸酶剩余活性的關(guān)系。
　　 摩爾比在0～100之間時(shí),尿酸酶氨基修飾度與修飾劑用量呈良好線性關(guān)系(y=0.67·X-4.96,R2=0.99);在摩爾比接近200時(shí),修飾度達(dá)到80%;摩爾比在200～500間修飾度平緩地接近85%。隨著修飾度增加,尿酸酶活性持續(xù)下降至原活性的17%。
　　 比較SS-mPEG5k,SS-mPEG3

5、50和乙酸琥珀酰亞胺酯衍生物對(duì)修飾產(chǎn)物活性的影響,發(fā)現(xiàn)SS-mPEG5k最大修飾度達(dá)到75%且對(duì)應(yīng)剩余活性為60～70%,SS-mPEG350最大修飾度達(dá)到86%且對(duì)應(yīng)剩余活性為23%,乙酸琥珀酰亞胺酯最大修飾度達(dá)到94%對(duì)應(yīng)剩余活性為10%。
　　 兩種尿酸酶抑制劑氧嗪酸和黃嘌呤,及其底物尿酸等配體都可顯著提高SC-mPEG5k修飾后尿酸酶活性保留比例。在摩爾比為200的修飾劑用量時(shí),無配體存在下尿酸酶修飾度達(dá)到80%但只保留

6、20-30%活性。30μM氧嗪酸可使尿酸酶修飾后保留活性達(dá)到70%、150μM黃嘌呤可使尿酸酶修飾后保留活性達(dá)到59%、(初始濃度)500μM尿酸可使尿酸酶修飾后保留活性達(dá)到53%。
　　 3 mPEG5k修飾尿酸酶成藥性的初步評(píng)價(jià)
　　 mPEG5k修飾尿酸酶的pH、Mg2+效應(yīng)方面與未修飾尿酸酶相似,而其熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶水解能力有顯著改善。用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀(Ki≦3μM)按每天0.20mg/g的劑量對(duì)SD大

7、鼠腹腔注射持續(xù)4-6周成功建立高尿酸血癥大鼠模型,大鼠血漿尿酸水平持續(xù)保持在0.42mM以上,而體內(nèi)尿酸酶抑制劑總量(氧嗪酸當(dāng)量)也維持在較高的水平,對(duì)尿酸酶藥效學(xué)的評(píng)價(jià)產(chǎn)生顯著的干擾。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了體外降尿酸能力與體內(nèi)代謝半衰期考察相結(jié)合的方法綜合評(píng)價(jià)mPEG5k修飾尿酸酶的藥效學(xué)和藥代學(xué)性質(zhì)。mPEG5k修飾尿酸酶與未修飾尿酸酶在體外血漿中都顯示出較好的降尿酸能力;未修飾尿酸酶在健康大鼠體內(nèi)活性衰減半衰期hf≈12min,mPEG

8、修飾尿酸酶代謝半衰期約20小時(shí)。禽類體內(nèi)缺乏內(nèi)源性尿酸酶。mPEG修飾尿酸酶在雞體內(nèi)有更長的活性衰減半衰期且可長時(shí)間維持體內(nèi)血漿尿酸在較低水平。未修飾尿酸酶有很強(qiáng)免疫原性,在家兔體內(nèi)抗尿酸酶IgG抗體滴度達(dá)到1:781250以上;大鼠體內(nèi),mPEG5k修飾尿酸酶的原有抗原反應(yīng)活性大幅下降至5%以下,與兔抗尿酸酶抗體的抗原反應(yīng)活性低于未修飾尿酸酶的10%,且出現(xiàn)了新的主要是針對(duì)mPEG的免疫原性。
　　 綜上所述,修飾劑結(jié)構(gòu)性質(zhì)、